[發(fā)明專利]一種麥芽寡糖基海藻糖水解酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810145937.6
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108103046B
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳敬;宿玲恰;王振棟
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12P19/14;C12P19/12;C12R1/19
• 代理公司: 23211 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種麥芽寡糖基海藻糖水解酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一系列麥芽寡糖基海藻糖水解酶突變體，應(yīng)用于制備海藻糖，具有比較好的效果。本發(fā)明還將麥芽寡糖基海藻糖水解酶突變體在E.coli BL21(DE3)中進行了表達、發(fā)酵優(yōu)化酶，可顯著提高酶的產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種麥芽寡糖基海藻糖水解酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

海藻糖(Trehalose)由兩個吡喃葡萄糖分子通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成，是一種穩(wěn)定的非還原性二糖，同時具有高度安全性和有良好的穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。自1995年以來，日本、美國和歐盟等先后批準(zhǔn)海藻糖可以用作食品添加劑。2005年，我國衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)海藻糖為新資源食品。

1993年日本林原生化研究所首次發(fā)現(xiàn)麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以液化淀粉作為底物，這兩種酶協(xié)同作用，可以生成海藻糖，并且率先實現(xiàn)了海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)。目前，我國已有公司開始生產(chǎn)海藻糖，但產(chǎn)品性能、產(chǎn)率與進口產(chǎn)品存在一定差距，并且生產(chǎn)成本一直居高不下。更為嚴(yán)峻的是，為了迎合市場需求，海藻糖售價不斷下降，給海藻糖生產(chǎn)帶來了巨大挑戰(zhàn)和壓力。因此如何提升海藻糖產(chǎn)率，實現(xiàn)海藻糖低成本規(guī)模化制備，使其走向大眾消費者的餐桌成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界關(guān)注的熱點。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖主要通過兩種方法：①利用海藻糖合成酶，以麥芽糖作為底物，通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用，生成海藻糖；②以淀粉液化液作為底物，經(jīng)麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)協(xié)同作用生產(chǎn)海藻糖。兩種方法生產(chǎn)海藻糖產(chǎn)率相近，但是，從生產(chǎn)成本以及周期考慮，以淀粉作為底物制備海藻糖，工藝更為簡便，成本更為低廉。因此，麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)協(xié)同作用生產(chǎn)海藻糖，更具優(yōu)勢。

國內(nèi)外雙酶法生產(chǎn)海藻糖包括中低溫酶系(來源菌包括Arthrobacter sp.Q36、Arthrobacter ramosus S34、Brevibaterium helvolum等)和高溫酶系(來源菌包括Sulfolobus solfataricus KM1和Sulfolohus acidocaldariusATCC 33909等)。高溫酶系通常具有較高的海藻糖轉(zhuǎn)化率，并且具有良好的熱穩(wěn)定性，能在較高溫度下轉(zhuǎn)化淀粉生成海藻糖，不容易在生產(chǎn)過程中污染雜菌。但是，高溫酶系相對于中低溫酶系，蛋白表達量低，不利于其工業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

基于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明利用基因工程和酶工程的手段，提高麥芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活，為其工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造條件。

本發(fā)明提供了具有酶活提高的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的突變體，包含了將來源于嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第140、202、218、323、338或404位的氨基酸中的一個或多個進行取代得到的突變體。這些突變體與其親代的麥芽寡糖基海藻糖水解酶相比，酶活提高。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述嗜酸熱硫化葉菌(S.acidocaldarius)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述來源于嗜酸熱硫化葉菌(S.acidocaldarius)的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。編碼所述來源于嗜酸熱硫化葉菌(S.acidocaldarius)的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第140位置的甲硫氨酸(Met)變成亮氨酸(Leu)，突變體命名為M140L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是將第202位置的亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，突變體命名為L202P。