[發明專利]一種麥芽寡糖基海藻糖水解酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201810145937.6
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108103046B
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;王振棟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12P19/14;C12P19/12;C12R1/19
• 代理公司: 23211 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司
• 代理人: 張勇

1.一種麥芽寡糖基海藻糖水解酶的突變體，其特征在于，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第140位置的甲硫氨酸(Met)變成亮氨酸(Leu)，突變體命名為M140L；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第202位置的亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，突變體命名為L202P；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第218位置的亮氨酸(Leu)變成天冬氨酸(Asp)，突變體命名為L218D；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第323位置的酪氨酸(Tyr)變成甘氨酸(Gly)，突變體命名為Y323G；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第338位置的苯丙氨酸(Phe)變成絲氨酸(Ser)，突變體命名為F338S；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第202位置的亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，同時第323位置的酪氨酸(Tyr)變成甘氨酸(Gly)，得到L202P/Y323G；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第202位置的亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，第218位置的亮氨酸(Leu)變成天冬氨酸(Asp)，同時第323位置的酪氨酸(Tyr)變成甘氨酸(Gly)，得到L202P/L218D/Y323G；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第140位置的甲硫氨酸(Met)變成亮氨酸(Leu)，第202位置的亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，第218位置的亮氨酸(Leu)變成天冬氨酸(Asp)，同時第323位置的酪氨酸(Tyr)變成甘氨酸(Gly)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第140位置的甲硫氨酸(Met)變成亮氨酸(Leu)，第202位置的亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，第218位置的亮氨酸(Leu)變成天冬氨酸(Asp)，第323位置的酪氨酸(Tyr)變成甘氨酸(Gly)，同時第338位置的苯丙氨酸(Phe)變成絲氨酸(Ser)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S；

或，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的第140位置的甲硫氨酸(Met)變成亮氨酸(Leu)，第202位置的亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，第218位置的亮氨酸(Leu)變成天冬氨酸(Asp)，第323位置的酪氨酸(Tyr)變成甘氨酸(Gly)，第338位置的苯丙氨酸(Phe)變成絲氨酸(Ser)，同時第404位置的異亮氨酸(Ile)變成蘇氨酸(Thr)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T。

2.編碼權利要求1所述突變體的基因。

3.攜帶權利要求2所述基因的載體或重組細胞。

4.制備權利要求1所述突變體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)根據確定的突變位點，設計定點突變的突變引物，以攜帶麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的載體為模板進行定點突變；構建含有編碼突變體的基因的質粒載體；

(2)將突變體質粒轉化進宿主細胞；

(3)挑選陽性克隆進行發酵培養，離心收集細胞，細胞破壁上清液即為突變體麥芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液。

5.一種生產麥芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，將表達權利要求1所述突變體的重組大腸桿菌接種至發酵培養基中，37℃培養8～14h，以0.1g·L^-1·h^-1的流速流加乳糖，并在30℃誘導10～20h。