[發(fā)明專利]肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810144867.2
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108226485B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 易龍;糜漫天;周曦;劉蕾;張玉;郎和東
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 李歐

本發(fā)明涉及細(xì)胞分離純化材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠及其制備方法，所述復(fù)合免疫磁珠為粒徑50～1500nm的磁珠顆粒上接枝抗體，所述抗體包括CD11b抗體和CD146抗體，所述磁珠顆粒的內(nèi)核為Fe₃O₄微球，由內(nèi)至外包括羧基化石墨烯層、改性殼聚糖層、海藻酸鈉層。本發(fā)明通過在磁珠顆粒上接枝抗體，得到復(fù)合免疫磁珠，磁珠顆粒上含有較多的羧基官能團(tuán)，在溶液中具有良好的分散性能，不容易發(fā)生團(tuán)聚，且抗體在該磁珠顆粒上的接枝率較高，結(jié)合的穩(wěn)性較強(qiáng)，可用于肝星狀細(xì)胞的分離純化，以便得到純度較高、活性較強(qiáng)的肝星狀細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞分離純化材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠及其制備方法。

背景技術(shù)

肝臟細(xì)胞分為肝實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞，非實質(zhì)細(xì)胞包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)、Kupffer細(xì)胞(KCs)、肝星狀細(xì)胞(HSCs)和隱窩細(xì)胞。肝星狀細(xì)胞的形態(tài)不規(guī)則，胞體呈圓形或不規(guī)則形，常伸出數(shù)個星狀胞突包繞著肝血竇。肝星狀細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有1～14個直徑約1.0～2.0μm的脂滴，脂滴里面富含維生素A，在紫外線激發(fā)下能自發(fā)藍(lán)綠色熒光。

自1953年Anderson創(chuàng)剪切法從肝臟分離肝細(xì)胞以來，各實驗室對肝細(xì)胞的分離方法進(jìn)行了不斷改進(jìn)，主要分為非灌流的方法和灌流的方法。非灌流的方法以其簡單易行的特點(diǎn)得到了一定的應(yīng)用，但由于存在消化不完全、分離得到的細(xì)胞中存在多細(xì)胞團(tuán)塊的問題，不能滿足許多基礎(chǔ)研究或臨床應(yīng)用的要求；灌流可以使消化液與肝組織更加充分地接觸，提高了分離效率，以及所得肝細(xì)胞的活力和數(shù)量大大提高。目前，利用肝星狀細(xì)胞在肝組織細(xì)胞中密度最低的原理，常采用兩步灌流法結(jié)合密度液梯度離心法，分離出肝星狀細(xì)胞。但是，肝星狀細(xì)胞的平均密度為1.053g/ml，KCs細(xì)胞的平均密度為1.076g/ml，而LSECs細(xì)胞的密度范圍為1.061～1.080g/ml，可見，肝星狀細(xì)胞、KCs細(xì)胞和LSECs細(xì)胞的密度差別不是很大，利用兩步灌流法和密度液梯度離心法很難分理出純度較高的肝星狀細(xì)胞，分離出的肝星狀細(xì)胞中混雜有LSECs細(xì)胞、KCs細(xì)胞。

免疫磁珠法是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的技術(shù)方法。1983年Ugelstad提出將免疫磁珠用于細(xì)胞分選，1990年，Mihenyi建立了MACS。這一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反應(yīng)性的抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，在細(xì)胞表面形成玫瑰花結(jié)，這些結(jié)合了磁珠的細(xì)胞一旦置于強(qiáng)大的磁場下，就會與其他未被結(jié)合的細(xì)胞分群，具超強(qiáng)順磁場的磁珠脫離磁場后立即消失磁性，這樣就可以篩選或去除所標(biāo)記的細(xì)胞，從而達(dá)到陽性或陰性選擇細(xì)胞的目的。這一技術(shù)目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用于細(xì)胞及分子生物學(xué)，分離基因、靶細(xì)胞及造血干細(xì)胞等。其分離效果得到了免疫熒光、PCR、FISH及FACS等方法的確認(rèn)。免疫磁珠可以有效地分選細(xì)胞，從而決定了這一方法在肝星狀細(xì)胞分離純化中應(yīng)用的技術(shù)可行性。但是，目前的免疫磁珠存在分散性能較差，容易發(fā)生團(tuán)聚，免疫磁珠上的抗體接枝率較低，且與抗體結(jié)合的穩(wěn)定性較差。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠及其制備方法，通過在磁珠顆粒上接枝抗體，得到復(fù)合免疫磁珠，磁珠顆粒上含有較多的羧基官能團(tuán)，在溶液中具有良好的分散性能，不容易發(fā)生團(tuán)聚，且抗體在該磁珠顆粒上的接枝率較高，結(jié)合的穩(wěn)性較強(qiáng)，可用于肝星狀細(xì)胞的分離純化，以便得到純度較高、活性較強(qiáng)的肝星狀細(xì)胞。

本發(fā)明通過以下技術(shù)手段解決上述技術(shù)問題：

肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠，所述復(fù)合免疫磁珠為粒徑50～1500nm的磁珠顆粒上接枝抗體，所述磁珠顆粒的內(nèi)核為Fe₃O₄微球，由內(nèi)至外包括羧基化石墨烯層、改性殼聚糖層、海藻酸鈉層。