[發(fā)明專利]肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810144867.2
• 申請(qǐng)日: 2018-02-12
• 公開（公告）號(hào): CN108226485B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易龍;糜漫天;周曦;劉蕾;張玉;郎和東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 李歐

1.肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠，其特征在于，所述復(fù)合免疫磁珠為粒徑50～1500nm的磁珠顆粒上接枝抗體，所述磁珠顆粒的內(nèi)核為Fe₃O₄微球，由內(nèi)至外包括羧基化石墨烯層、改性殼聚糖層、海藻酸鈉層；所述改性殼聚糖是羧基化的分散性納米二氧化硅與殼聚糖經(jīng)過脫水反應(yīng)制得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠，其特征在于，所述抗體包括CD11b抗體和CD146抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠，其特征在于，所述磁珠顆粒中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％～20％的Fe₃O₄微球、25％～40％的改性殼聚糖、20％～35％的海藻酸鈉。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠，其特征在于，所述Fe₃O₄微球是采用蛋清液致孔、經(jīng)等離子體處理后的多孔微球。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠，其特征在于，所述分散性納米二氧化硅是用γ-氨丙基三甲氧基改性后的納米二氧化硅。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一所述的肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

取Fe₃O₄微球和羧基化石墨烯攪拌分散于質(zhì)量濃度為25％的乙二醇溶液中，于200～240℃的馬弗爐中反應(yīng)10～13h，隨爐冷卻取出，磁分離洗滌得到石墨烯/Fe₃O₄微球；

取殼聚糖溶解于質(zhì)量濃度為2％的乙酸溶液中，隨后加入石墨烯/Fe₃O₄微球，攪拌分散均勻，先后攪拌加入石油醚、甲醛、戊二醇，于60～65℃反應(yīng)5～8h，抽濾，用乙醇和蒸餾水洗滌，真空干燥得到殼聚糖/石墨烯/Fe₃O₄微球，取殼聚糖/石墨烯/Fe₃O₄微球均勻分散于正丁醇中，再加入羧基化的分散性納米二氧化硅，加熱至60～65℃恒溫反應(yīng)8h，冷卻，磁分離洗滌，真空干燥，得到改性殼聚糖/石墨烯/Fe₃O₄微球；

取海藻酸鈉溶解于蒸餾水中，再加入改性殼聚糖/石墨烯/Fe₃O₄微球攪拌2h，冷凍干燥得到磁珠顆粒；

采用含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的PBS緩沖液活化磁珠顆粒后，將活化的磁珠顆粒和抗體加入PBS緩沖液中反應(yīng)15～20h，磁分離得到免疫磁珠，再用含1wt％的牛血清白蛋白緩沖液封閉免疫磁珠30min，保存于2～5℃的環(huán)境中。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠的制備方法，其特征在于，所述Fe₃O₄微球的制備如下：取等摩爾的Fe₂(SO₄)₃和FeSO₄·7H₂O溶解于蒸餾水中，再加入蛋清液于60～65℃攪拌反應(yīng)30h，減壓干燥、研碎，并轉(zhuǎn)入至450℃馬弗爐中保溫6h，隨后取出用冰水混合液降溫，用蒸餾水和無水乙醇各洗2遍，干燥得到的粉末裝入反應(yīng)器中進(jìn)行等離子體處理，得到Fe₃O₄微球。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠的制備方法，其特征在于，所述Fe₃O₄微球制備中的等離子體處理工藝條件為：氬氣流量80～120sccm、壓力3～8Pa、功率80～100W等離子體處理10～15min。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肝星狀細(xì)胞分離純化用的復(fù)合免疫磁珠的制備方法，其特征在于，所述羧基化石墨烯的制備如下：取石墨烯加入濃度為0.3mol/L的氫氧化鈉溶液中超聲波分散3h，隨后加入氯乙酸超聲波反應(yīng)3h得到反應(yīng)液，將反應(yīng)液用去離子水反復(fù)離心洗滌至中性，干燥得到羧基化石墨烯。