[發明專利]高效能mRNA標記偵測試劑組的偵測方法

在審

• 申請號: 201810144169.2
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108562575A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 林繡茹;楊智凱;吳昌翰;林維純
• 申請（專利權）人: 翊準國際生物科技股份有限公司;蘇州翊準基因科技有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 何為;李宇

一種高效能mRNA標記偵測試劑組的偵測方法，系以十二種試劑參與基因芯片反應流程，至少包括RNA萃取、生物素標定、雜合反應、以及訊號偵測步驟。本發明不包含PCR核酸放大技術，并將RNA反轉錄反應與生物素標定整合為一個步驟，再透過創新配方與重復反應達到相對應的功效。其中生物素標定試劑配方的創新處，在于包含反轉錄反應的試劑，因此無須分開兩個步驟進行。而該重復反應乃指重復進行反轉錄級生物素標定，可加強雜合反應后的訊號。藉此，透過本發明提出的高效能mRNA標記偵測試劑組的偵測方法，可于臨床檢驗檢查時，不需進行放大，透過基因芯片就可以檢測檢體中所的基因表現，具有較高的靈敏度及較佳的方便性，能達到一次滿足高靈敏度及便利性的需求。

技術領域

本發明有關于一種高效能mRNA標記偵測試劑組的偵測方法，尤指涉及一種不包含PCR核酸放大技術，并將RNA反轉錄反應與生物素標定整合為一個步驟，再透過創新配方與重復反應達到相對應的高效能mRNA標記偵測試劑組的偵測方法。

背景技術

對基因過渡表現（Overexpression）的分析已經導致疾病診斷的基本進步與臨床進展。而研究基因過渡表現的技術包含有北方墨點法（Northern Blot）、反轉錄聚合酶鏈鎖反應（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）及實時定量聚合酶鏈鎖反應（Real-Time PCR）。其中北方墨點法由于操作步驟十分繁瑣，所需檢體量又過多，因此僅限于研究操作上，無法實際應用于臨床診斷。至于反轉錄聚合酶鏈鎖反應RT-PCR及實時定量聚合酶鏈鎖反應Real-Time PCR由于操作步驟簡便，因此在單一基因檢測的應用上，使用相當廣泛，例如肝炎病毒的檢測及感染癥病原菌的鑒定。然而，雖然PCR（聚合酶鏈鎖反應序列）的創作是作為整體最偉大的實驗，但多數PCR技術仍保有特定的共同問題，其主要問題包含有：首先為污染，過渡靈敏偵察的偽陽性，例如霧式的DNA或先前的樣品殘余；其次，為RT-PCR僅被認為半定量，因為當比較不同的樣品時，難以控制序列放大效率；再者，由于所需引子（Primer）間黏合（Annearling）的干擾，無論RT-PCR或Real-Time PCR都僅廣泛應用于單一基因標的檢測，當檢測標的為基因群時，則PCR相關的技術則有操作耗時、費事及高成本等缺點。

隨著近幾年來生物科技的快速發展，生物芯片于臨床醫學診斷或藥效評估上的應用逐漸被重視，本發明的先前研究已開發并且評估一尼龍膜芯片（Membrane Array）方法，能使用于癌癥診斷，在血液檢體（Peripheral Blood）中同時查出一多種mRNA標記引物的表現。其分子標志的表現由RT-PCR與尼龍膜芯片評估，數據從RT-PCR與尼龍膜芯片取得，且受制于線性回歸分析，顯示在這兩個方法結果之間的高度相互關系（r=0.979，P<0.0001）。另外，以相關衍生技術的加權化學冷光型基因芯片（Weighted Chemiluminescent MembraneArray, WCHMA），用于肺癌（Lung Cancer）患者的血液檢體分析標的治療藥物（TargetTherapeutic Drug）的作用標的K-ras的異常情形，也已被接受刊登于肺癌期刊中。

雖然尼龍膜芯片于分子診斷及藥效評估上的應用已有許多報告提出，然而，由于原始尼龍膜芯片所使用判讀方法上，對于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下，造成檢測特異性在達到一定程度之后便不易提升。對此，本發明人研究開發了一基因群檢測結構，雖可大量并快速進行生物檢體檢測分析，但其檢測過程需要先行放大，并無法達到直接從血液檢測透過基因芯片就能偵測血液里的基因表現，導致在芯片檢測靈敏度及方便性等方面的要求仍嫌不足。于是，本發明再研究開發一酵素型基因芯片偵測試劑組結構，雖然不需進行放大，即可達到直接從血液檢測透過基因芯片就能偵測血液里的基因表現，但其包含RNA萃取、cDNA合成、探針標志、雜交反應、以及訊號偵測等繁復的操作步驟，且其雜交反應僅一階段溫控，所耗反應時間長（需至少6.4小時以上）；因此，整體而言，該技術造成偵測所需時間冗長及耗費大量溶劑清洗（六階段清洗步驟），導致成本增加且降低效率與效能之余，其產出訊號時背景值亦較高，更有訊號易失真等問題。故，一般已用者無法符合使用者于實際使用時的所需。