[發明專利]一種質粒提取方法

在審

• 申請號: 201810142011.1
• 申請日: 2018-02-11
• 公開（公告）號: CN108048456A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 徐宇虹;陳鳴曉
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 李艷;許亦琳

本發明涉及一種質粒提取方法，包括如下步驟：（1）將含有質粒的菌體裂解液上樣第一層析柱，使用第一溶液進行洗脫，收集含有質粒的洗脫液，獲得第一洗脫液；（2）將所述第一洗脫液上樣第二層析柱，使用第二溶液進行洗脫，收集含有質粒的洗脫液，獲得第二洗脫液；（3）將所述第二洗脫液上樣第三層析柱，使用第三溶液進行洗脫，收集含有質粒的洗脫液，獲得第三洗脫液；（4）將所述第三洗脫液上樣第四層析柱，使用第四溶液洗脫，收集含有質粒的洗脫液，獲得第四洗脫液。本發明涉及的質粒提取方法提高了質粒提取過程中質粒的回收率。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種質粒提取方法。

背景技術

質粒(plasmid)是細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體(或擬核)以外的DNA分子，存在于細胞質中，具有自主復制能力，一般包括超螺旋、開環和線性三種結構，其中超螺旋結構的質粒DNA在細胞中的轉化和表達效率最高。質粒的長度一般在2-20kbp，分子量一般在106以上，質粒DNA分子因具有磷酸基團而顯負電，也會與一些基團發生特異性結合。

目前基于質粒DNA的基因編輯和調控技術已廣泛應用于科學研究，農業檢測，醫療診斷等領域中，在疾病治療研究中乃至臨床上的應用倍受矚目。

基因編輯和基因治療是利用基因修正手段從分子水平上進行疾病治療的新興技術。治療機理主要是通過基因轉移技術獎攜帶治療性基因的外源基因導入病變細胞中從而修飾或阻斷致病基因，從而實現對疾病的治療。因質粒DNA分子具有更好的安全性及更低的毒性和免疫原性等優點，高質量DNA質粒的大規模的分離純化技術被迫切需要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種質粒提取方法，用于提取不同大小的質粒和提高質粒提取的回收率。

本發明提供了一種質粒提取方法，包括如下步驟：(1)將含有質粒的菌體裂解液上樣第一層析柱，使用第一溶液進行洗脫，收集含有質粒的洗脫液，獲得第一洗脫液；其中，所述第一層析柱填料為瓊脂糖凝膠6FF；(2)將所述第一洗脫液上樣第二層析柱，使用第二溶液進行洗脫，收集含有質粒的洗脫液，獲得第二洗脫液；其中，所述第二層析柱填料為瓊脂糖珠與固定在瓊脂糖珠上的2-巰基吡啶配體；(3)將所述第二洗脫液上樣第三層析柱，使用第三溶液進行洗脫，收集含有質粒的洗脫液，獲得第三洗脫液；其中，所述第三層析柱填料為葡聚糖；(4)將所述第三洗脫液上樣第四層析柱，使用第四溶液洗脫，收集含有質粒的洗脫液，獲得第四洗脫液；其中，所述第四層析柱填料為帶有季銨基團單苯乙烯/二乙烯基苯珠粒。

在一種可能的實現方式中，所述第四溶液為1.0M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5。

在一種可能的實現方式中，在所述步驟(4)中，所述第四溶液洗脫為線性梯度洗脫。

在一種可能的實現方式中，所述線性梯度洗脫為流動相中的第四溶液的含量由0％升至100％。

在一種可能的實現方式中，在所述步驟(4)中，在將所述第三洗脫液上樣第四層析柱之前，使用第五溶液平衡所述第四層析柱；其中，所述第五溶液為10mM EDTA,100mMTris-HCl,pH 7.5。

在一種可能的實現方式中，所述第三層析柱的徑高比為13:40-13:60；優選地，徑高比為13:50。

在一種可能的實現方式中，在所述步驟(1)中，上樣量為所述第一層析柱填料體積的20％-40％；優選地，上樣量為所述第一層析柱填料體積的30％；更優選地，上樣量為所述第一層析柱填料體積的20/53。

在一種可能的實現方式中，所述第一溶液為2.1M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mMTris,pH 7.5。