[發(fā)明專利]絲素水凝膠包裹的過表達ncRNA的MSC外泌體制備方法與在抗后肢衰老中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810140513.0
• 申請日: 2018-02-11
• 公開（公告）號: CN110144324A
• 公開（公告）日: 2019-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李楊欣;韓超珊
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K9/06;A61P39/00;A61P9/10
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 常亮

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及絲素水凝膠包裹的過表達ncRNA的MSC外泌體制備方法與在抗后肢衰老中的應(yīng)用。本發(fā)明選用外泌體來傳遞ncRNA，進一步采用絲素蛋白水凝膠來包裹外泌體。實驗表明，經(jīng)包裹的外泌體能夠緩慢和穩(wěn)定的釋放到細胞外基質(zhì)中，提高了外泌體的滯留時間，并能夠?qū)⑦^表達的ncRNA轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及絲素水凝膠包裹的過表達ncRNA的MSC外泌體制備方法與在抗后肢衰老中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

衰老和很多人類疾病相關(guān)，如心血管疾病，神經(jīng)退行性疾病，癌癥和代謝功能障礙等疾病。由于全世界有大量人口經(jīng)受著這些疾病，同時衰老相關(guān)表型造成老年人異常虛弱，因此很多人對了解衰老的原因以及如何預(yù)防衰老過程有著濃厚的興趣。比如在心臟衰老的過程中，活性氧和TGF-β信號途徑增加，基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑之間的失衡以及線粒體中積累的DNA突變，這將會導(dǎo)致心血管平衡發(fā)生變化，隨后增加心肌細胞體積，降低心肌細胞數(shù)量，增加心肌胞外基質(zhì)沉積特別是膠原蛋白，最后導(dǎo)致左心室肥厚，纖維化和心臟舒張功能障礙。因此如何延緩個體器官衰老成為全人類迫在眉睫的任務(wù)。

目前涉及延緩衰老的相關(guān)治療方法，例如，中藥，運動和熱量限制均通過減少產(chǎn)生有害的代謝副產(chǎn)物和激活“長壽途徑”從而延長壽命。研究還發(fā)現(xiàn)，心臟祖細胞、心臟干細胞、胚胎干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體對心肌梗死后心臟發(fā)揮有益作用。此外非編碼RNA(ncRNA)在心肌梗死和心臟衰老中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄翻譯后調(diào)控作用，特別是長度約22個核苷酸的微小RNA(miRNA)。一些異常表達的miRNA在心臟生理和衰老中發(fā)揮作用。例如，miR-34a在衰老的小鼠心臟和人類心臟中表達上調(diào)，沉默miR-34a會減少心肌細胞的凋亡，其機制是miR-34a通過靶定PNUTS影響DNA損傷反應(yīng)途徑從而減少端粒縮短和DNA損傷,下調(diào)miR-34a能明顯延緩小鼠衰老狀況。總之，對miRNA的研究表明，miRNA具有作為診斷衰老的標(biāo)記物或治療靶點的潛力。而心臟和后肢衰老過程中miRNA如miRNA-675均下調(diào)，并通過預(yù)測和實驗驗證該miRNA參與抑制衰老相關(guān)的的下游靶基因和分子通路。因此我們提出使用該miRNA mimics進行預(yù)防和延緩衰老。

因為miRNA是短鏈核苷酸序列，因此通過miRNA對個體治療無個體間差異，能避免外來分子造成的免疫原性。miRNA治療是近年發(fā)展起來的一項新型臨床前沿技術(shù)，其原理是通過將miRNA移植到接近衰老的組織或者缺血的后肢組織，從而下調(diào)衰老相關(guān)的蛋白，延緩后肢的衰老進程，進而促進血流恢復(fù)，后肢耐力等。

裸露的miRNA容易受到血液組織液或細胞外基質(zhì)內(nèi)RNase的降解，因此提高miRNA運輸?shù)桨屑毎男誓苓M一步miRNA的治療效果。目前常用的方法是采用miRNA分子進行治療需要將miRNA分子與細胞外基質(zhì)的酶隔離開來，以保證miRNA能穩(wěn)定的運輸?shù)桨屑毎麅?nèi)。目前常用的方法是將miRNA分子進行修飾(如鎖核苷酸修飾)以及使用慢病毒過表達載體，納米物質(zhì)或水凝膠過表達miRNA載體或成熟的miRNA將其運輸?shù)桨卸ńM織中。盡管最新研究表明，miRNA的鎖核苷酸修飾和慢病毒過表達載體在傳遞miRNA時效果良好，但是鎖核苷酸修飾對分子效果和后續(xù)的降解的影響未可知，而盡管慢病毒是在HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)病毒基礎(chǔ)上改造而成的自身失活性的病毒載體系統(tǒng)，但是在大眾的認(rèn)知里直接注射慢病毒載體相對難以接受。因此使用對心臟有益的外泌體來遞送miRNA，一方面避免了其與細胞外環(huán)境接觸，另一方面，外泌體能和細胞膜融合或者被細胞內(nèi)吞從而直接將miRNA遞送到細胞內(nèi)。由于衰老是一個自然而緩慢的過程，而使用外泌體傳遞miRNA的半衰期較短，而如何提高外泌體在組織中的滯留時間仍是研究的難點。為了模擬個體衰老過程中發(fā)生的細胞凋亡，增殖降低，炎癥增加，身體機能下降等，我們擬采用小鼠后肢急性缺血模型來部分模擬組織的自然衰老。

發(fā)明內(nèi)容