[發明專利]檢測25-羥基維生素D的熒光層析試劑盒及其定量檢測方法

在審

• 申請號: 201810139923.3
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108181465A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 夏宣喜;賴華;朱華琳;鄧曉俠
• 申請（專利權）人: 廣東優尼德生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/577;G01N33/533
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 胡海國;徐進之

1.一種檢測25-羥基維生素D的熒光層析試劑盒，包括試紙殼和樣本稀釋液，所述試紙殼上設置有加樣窗口和檢測窗口，所述試紙殼內設有試紙條，其特征在于，所述試紙條包括PVC襯板、硝酸纖維素膜、偶合物結合墊片、樣本墊片及吸水墊片，所述PVC襯板上粘貼有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜的一端粘貼有偶合物結合墊片，另一端粘貼有吸水墊片，所述偶合物結合墊片上粘貼有樣本墊片；

所述硝酸纖維素膜上設置有測試帶和控制帶，所述測試帶內包被有鼠抗25-羥基維生素D抗體，所述控制帶內包被有兔抗鼠抗體；所述偶合物結合墊片包被有熒光標記25-羥基維生素D抗體；其中，所述樣本墊片位于所述加樣窗口處，所述測試帶和所述控制帶位于所述檢測窗口處。

2.如權利要求1所述的檢測25-羥基維生素D的熒光層析試劑盒，其特征在于，所述硝酸纖維素膜按如下步驟制備：

分別將測試帶抗體原液和控制帶抗體原液在4℃下以6000～13000r/min速度離心60min，吸取兩種上清液；

將兩種上清液分別裝入透析袋，用雙蒸水透析去除鹽分后，超濾濃縮后裝瓶冷凍，得到測試帶抗體和控制帶抗體；

用pH值為6.5～6.7的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液分別稀釋兩種抗體，得到0.8mg/ml測試帶包被液和0.8mg/ml控制帶包被液；

將所述測試帶包被液和所述控制帶包被液分別噴涂在硝酸纖維素膜對應的測試帶和控制帶位置，噴涂量為1μL/cm；

再將包被好硝酸纖維素膜置于37℃溫度下烘干。

3.如權利要求2所述的檢測25-羥基維生素D的熒光層析試劑盒，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液按重量計包括：Na₂HPO₄ 0.263-0.376份，KH₂PO₄ 1.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸餾水1000份；

所述Tris緩沖液按重量計包括：三羥甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH₂PO₄2.0-3.0份，NaCl8份，KClO₄份，牛血清白蛋白9份，蒸餾水1200份。

4.如權利要求1所述的檢測25-羥基維生素D的熒光層析試劑盒，其特征在于，所述偶合物結合墊片按如下步驟制備：

用pH值為6.4～6.6的MES溶液洗滌熒光微球，8000～15000r/min速度離心30min，去除上清液，重復操作兩次；

用MES溶液重懸熒光微球，并加入活化劑，活化30min；

用pH值為6.4～6.6的MES溶液洗滌活化的熒光微球，8000～15000r/min速度離心30min，去除上清液，重復操作兩次；

用pH值為8.5～9.5的硼酸溶液重懸活化的熒光微球，加入25-羥基維生素D鼠單克隆抗體，室溫下震蕩混勻，8000～15000r/min速度離心30min，去除上清液；

用質量分數為5％的BSA溶液重懸活化的熒光微球，室溫下震蕩反應1h，8000～15000r/min速度離心30min，去除上清液；

用pH值為8.5～9.5的硼酸溶液重懸活化的熒光微球，8000～15000r/min速度離心30min，去除上清液，即得熒光標記25-羥基維生素D抗體；

用PBS溶液將所述熒光標記25-羥基維生素D抗體稀釋10倍后，均勻地噴涂到偶合物結合墊片上，噴涂量為25μL/cm，于37℃溫度下烘干即得包被有熒光標記25-羥基維生素D抗體的偶合物結合墊片。

5.如權利要求4所述的檢測25-羥基維生素D的熒光層析試劑盒，其特征在于，所述熒光微球為羧基熒光微球，所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；或者所述熒光微球為氨基微球，所述活化劑為N-羥基琥珀酰亞胺；或者所述活化劑為羥基微球，所述活化劑為BrCN。