[發(fā)明專利]豬流行性腹瀉病毒及其分離方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810139481.2
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108130316A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 杜久斌;李延濤;賀筍;李俊輝
• 申請（專利權）人: 天康生物股份有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;A61K39/215;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 楊靜安

本發(fā)明提供了一種豬流行性腹瀉病毒及其分離方法和應用，涉及生物技術領域，本發(fā)明提供的豬流行性腹瀉病毒的分離純化方法，采用聚乙二醇6000對豬流行性腹瀉病毒進行分離。該方法操作簡單，實用性強，能夠有效地對豬流行性腹瀉病毒進行分離，且分離得到的豬流行性腹瀉病毒純度及病毒效價均較高。利用上述豬流行性腹瀉病毒制備得到的組織滅活疫苗雜蛋白少，且每批疫苗批間差異小，免疫效果好，副作用小。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種豬流行性腹瀉病毒及其分離方法和應用。

背景技術

豬流行腹瀉病毒(PEDV)，屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬。豬流行性腹瀉是由病毒引起的仔豬和育肥豬的一種急性腸道傳染病。本病與傳染性胃腸炎很相似，在我國多發(fā)生在每年12月份至翌年1-2月，夏季也有發(fā)病的報道。可發(fā)生于任何年齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率高。各種年齡的豬都能感染發(fā)病。哺乳豬、架子豬或肥育豬的發(fā)病率很高，尤以哺乳豬受害最為嚴重，母豬發(fā)病率變動很大，約為15-90％。病豬是主要傳染源。

近幾年豬流行性腹瀉病毒出現(xiàn)了變異株，導致經(jīng)典的CV777毒株疫苗不能對豬場豬流行性腹瀉達到有效的保護。豬流行性腹瀉變異毒株在細胞上分離困難，并且在細胞上產(chǎn)生毒價低，影響豬流行性腹瀉疫苗的保護效果。通常豬場利用反飼和制備組織滅活疫苗來預防該病的感染，反飼風險大，豬場制備的組織滅活疫苗雜蛋白多、每批苗批間差異較大，導致組織苗免疫后副反應大，保護效果不確實。

因此，開發(fā)一種方法簡單、操作便捷的針對豬流行性腹瀉病毒的分離純化方法，使分離得到的豬流行性腹瀉病毒的純度高，制備得到的疫苗批間差異小尤為重要。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒的分離純化方法，以緩解現(xiàn)有技術中存在的豬流行性腹瀉變異毒株在細胞上分離困難，并且在細胞上產(chǎn)生毒價低，用以制備疫苗會影響豬流行性腹瀉疫苗的保護效果的技術問題。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種應用上述分離方法分離得到的豬流行性腹瀉病毒，以緩解現(xiàn)有技術中存在的豬流行性腹瀉病毒純度不高且效價低的技術問題。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種應用上述豬流行性腹瀉病毒制備得到的組織滅活疫苗，以緩解現(xiàn)有技術中存在的豬流行性腹瀉自家組織苗雜蛋白含量多、批間抗原濃度差異較大的技術問題。

本發(fā)明提供了一種豬流行性腹瀉病毒的分離純化方法，采用聚乙二醇6000對豬流行性腹瀉病毒進行分離。

進一步地，所述分離方法包括：

提供豬流行性腹瀉組織病料進行處理后得到的上清液，將聚乙二醇6000及鈉鹽加入所述上清液中并進行一次離心，得到沉淀，將所述沉淀重懸并進行二次離心，收集二次離心上清液，得到所述豬流行性腹瀉病毒。

進一步地，將豬流行性腹瀉組織病料進行研磨后反復凍融，然后加入3-5倍體積的緩沖液混勻，離心，得到所述豬流行性腹瀉組織病料進行處理后得到的上清液；

優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉組織病料為發(fā)病仔豬腸組織；

優(yōu)選地，所述反復凍融為在-20℃下反復凍融2-4次，優(yōu)選為3次。

進一步地，加入3-5倍體積的緩沖液混勻，在4℃靜置1-3小時后，取上清進行離心，得到所述豬流行性腹瀉組織病料進行處理后得到的上清液；

優(yōu)選地，所述離心的條件為4℃，4500-5500r/min離心25-35分鐘。

進一步地，所述聚乙二醇6000在上清液中的終濃度為6％-10％，優(yōu)選為7％-9％，更優(yōu)選為8％；

所述鈉鹽在上清液中的終濃度為0.1％-2％，優(yōu)選為0.5％-1.5％，更優(yōu)選為1％。