[發明專利]一種制備細菌菌影的方法

有效

• 申請號: 201810139232.3
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108410785B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 王春來;劉思國;于申業;李剛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所(中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心);哈爾濱維科生物技術開發公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/19
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

本發明涉及一種制備細菌菌影以及基因工程亞單位疫苗的方法，包括將INP信號序列和外源基因以及裂解盒基因E?lysis克隆到同一個表達載體，轉化細菌，其中INP的信號序列為SEQ ID NO：1表示的序列，裂解盒基因E?lysis的序列為SEQ ID NO：2表示的序列，以及表達外源基因的重組細菌菌影在制備疫苗中的應用。

技術領域

本發明涉及細菌表面展示技術，即利用信號序列INP作為外源抗原蛋白的引導序列，將外源抗原蛋白定位于細菌的表面；本發明還涉及細菌菌影制備技術，將細菌表面展示技術與細菌菌影制備技術融合在一起，建立了細菌菌影表面展示技術平臺。屬于基因工程疫苗領域。

背景技術

細菌菌影(Bacterial ghost)是一種沒有細胞漿和核酸的空細菌體。將PhiX174噬菌體E打孔基因在細菌中表達，該基因編碼蛋白在細菌細胞膜和胞壁上可形成穿膜孔道，在滲透壓的作用下使菌體破裂，細菌胞內細胞漿和核酸成分通過此孔道被排出，形成一種空的細菌外殼，即為細菌菌影。菌影是由內膜(cytoplasmic membrane)，胞漿間隙(periplasmic space)和外膜(outer membrane)組成，因此細胞壁在很大程度上被完整保存下來。在有些菌株的外膜上還有一層S-layer，也成為菌影的成分之一。菌影本身可作為一種很好的疫苗，因為這種形式保留了和活菌一樣的細菌胞膜結構和相關抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫細胞通過模式識別受體識別的高度保守結構PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖，肽聚糖，CPG，OmpA，菌毛等，能有效地被DC和巨噬細胞所吞噬。目前，菌影通過靜脈、皮下、氣體等途徑免疫已經在小鼠、兔子、豬等動物模型中取得了良好的免疫保護效果。霍亂菌菌影(VCG) 經皮下注射小鼠誘導血清產生高水平的抗霍亂特異性IgG抗體。同時顯示，針對VCG的抗體足以保護新生小鼠免遭霍亂弧菌的感染。

另外，細菌菌影還可以用作一種極好的遞呈系統，通過在細菌裂解之前對細菌進行外膜的人工改造，將外來抗原，核酸或藥物等其它成分錨定于胞膜的內、外側，或充于胞漿周質。這樣制備的重組菌影擁有完好的，天然的細菌外膜結構，能同時激發體液和細胞免疫應答。其菌毛等表面黏附結構，又使之能靶向黏附在特異性的組織，如胃腸道和呼吸道的黏膜表面，進而較易被機體吞噬細胞，如PP結(Peyer’s Patches)的M 細胞所識別捕獲，故而可有效遞送疫苗抗原至黏膜表面和誘發相關黏膜免疫應答。Eko等人將沙眼衣原體(C.trachomatis)抗原在霍亂菌的內膜表達，然后裂解制備的重組菌影(VCG)有效地激發了生殖道黏膜的Th1型免疫應答，現在正在著手進行臨床實驗。與傳統的原核系統表達蛋白相比，重組菌影有幾大優勢：(1)重組蛋白被整合在一個具有高度免疫原性的環境中；(2)對蛋白的大小要求范圍寬泛，但蛋白的分子量最好在2000 到200,000Da之間；(3)重組蛋白被直接表達后整合到細菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫動物，而不必要象以前制備免疫原時要先分離純化重組蛋白；(4)整合在細胞壁的重組蛋白具有天然的構象，所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重組的蛋白通過原核系統大都以包涵體的形式表達，只能通過變性、復性的方法在一定程度上恢復蛋白活性。(5)菌影的制備相對簡單，可用發酵技術獲得，而不需進行復雜的純化工作；可以凍干的形式貯存于室溫。

發明內容

本發明的目的是建立一種全新的、基于細菌菌影的表面展示技術平臺，為基因工程疫苗的研制開辟一個新的領域，提供一個有力的工具。

本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的：

一種信號序列INP，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示；一種裂解盒基因E-lysis，其核苷酸序列為SEQ ID NO：2所示。

在本發明的一個方面，提供了一種制備細菌菌影的方法，包括將INP 信號序列和裂解盒基因E-lysis克隆到同一個表達載體，轉化細菌，其中 INP的信號序列為SEQ ID NO：1表示的序列，裂解盒基因E-lysis的序列為SEQ ID NO：2表示的序列。