[發明專利]一種RT-PCR檢測獼猴桃軟腐病原菌的引物及其方法

在審

• 申請號: 201810138697.7
• 申請日: 2018-04-11
• 公開（公告）號: CN108179219A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 李艷;石軍;蒲博
• 申請（專利權）人: 綿陽師范學院;綿陽市農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

本發明提供了一種實時熒光RT?PCR檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特異性引物，其由正向引物和反向引物組成，所述正向引物為：5＇?TTCAGCCTCGGATTACGGTC?3＇如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物為：5＇?CTCGTGCATGGTGGTCTTGT?3＇，如SEQ ID NO.2所示；利用所述特異性引物進行實時熒光RT?PCR檢測比進行PCR檢測的靈敏度至少提高100倍。本發明還提供基于該特異性引物的試劑盒、檢測方法和應用。

技術領域

本發明屬于農業及植物檢疫技術領域，具體涉及一種實時熒光RT-PCR檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的引物及其檢測方法和應用。

背景技術

獼猴桃被稱為水果之王和維生素C之冠，具有較高的經濟效益，國內的主要種植區有四川、陜西和貴州等地。對于獼猴桃病害的檢測、防控，是提高其經濟價值，促進地區獼猴桃行業經濟發展的必要手段。

軟腐病是獼猴桃病害的主要病原菌之一。該病原菌在6月中旬至9月底有很高的產孢能力，當獼猴桃幼果感染該菌時，會嚴重影響果實的生長，在6月感染時，容易發生采前落果。該病原菌對于果底部和果中部均有較強的侵染能力。

實時熒光PCR檢測法具有獨特的優勢，可以精確的檢測不同組織、不同材料中病原菌的相對含量，得到了廣泛的應用，如中國專利CN 201110316557.2公布了一種檢測甘蔗宿根矮化病菌的實時熒光定量PCR方法，中國專利CN 201510051864.0公布了一種蘋果莖溝病毒實時熒光定量PCR檢測方法。

不過，在檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea方面，尚未發現效果較好的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物。

因此，研究開發適于檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物及其檢測方法，對于獼猴桃軟腐病的檢測、預防和控制具有良好的學術和經濟意義。

發明內容

針對現有技術的缺點，本發明的目的之一在于提供一種實時熒光RT-PCR檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特異性引物，所述特異性引物由正向引物和反向引物組成，所述正向引物為：5＇-TTCAGCCTCGGATTACGGTC-3＇如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物為：5＇-CTCGTGCATGGTGGTCTTGT＇，如SEQ ID NO.2所示；利用所述特異性引物進行實時熒光RT-PCR檢測比進行PCR檢測的靈敏度至少提高100倍。

本發明的另外一個目的在于提供包含上述特異性引物的實時熒光RT-PCR檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的試劑盒。本發明還有一個目的在于提供一種實時熒光RT-PCR檢測獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將提取的獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea標準品的DNA進行10倍梯度稀釋，得到梯度稀釋的獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的DNA，以其為模板，以SEQ ID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子分別作為正向引物和反向引物進行實時熒光定量PCR擴增，以模板濃度的Log值為縱坐標，以擴增得到的Ct值作為橫坐標，制作標準曲線；

(2)從獼猴桃果品中提取DNA，并將其稀釋至步驟(1)所得標準曲線范圍內；以SEQID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子引物進行實時熒光定量PCR擴增，得Ct值，然后根據步驟(1)所得標準曲線計算出目標片段的拷貝數。

一般情況下，步驟(2)中，可選的提取DNA的方法為CTAB法。

具體到本發明而言，所述CTAB法可以具體以下述步驟進行：