[發(fā)明專利]一種RT-PCR檢測(cè)獼猴桃軟腐病原菌的引物及其方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810138697.7
• 申請(qǐng)日: 2018-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN108179219A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李艷;石軍;蒲博
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 綿陽(yáng)師范學(xué)院;綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 成都帝鵬知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

1.一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物由正向引物和反向引物組成，所述正向引物為：5＇-TTCAGCCTCGGATTACGGTC-3＇，如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物為：5＇-CTCGTGCATGGTGGTCTTGT-3＇，如SEQ ID NO.2所示；利用所述特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)比進(jìn)行PCR檢測(cè)的靈敏度至少提高100倍。

2.一種包含權(quán)利要求1所述特異性引物的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的試劑盒。

3.一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)將提取的獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea標(biāo)準(zhǔn)品的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到梯度稀釋的獼猴桃軟腐病原菌Botryosphaeria dothidea的DNA，以其為模板，以SEQ ID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子分別作為正向引物和反向引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以模板濃度的Log值為縱坐標(biāo)，以擴(kuò)增得到的Ct值作為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)從獼猴桃果品中提取DNA，并將其稀釋至步驟(1)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)；以SEQ IDNO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得Ct值，然后根據(jù)步驟(1)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出目標(biāo)片段的拷貝數(shù)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，提取DNA的方法為CTAB法。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述CTAB法的步驟為：

1)取適量的獼猴桃果品放入1.5ml EP管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；

2)加入550μL 65℃預(yù)熱的CTAB提取液，劇烈振蕩后，放于65℃恒溫箱中1h，其間間隔10min振蕩混勻一次

3)加入550μL氯仿-異戊醇，劇烈震蕩并充分混勻，靜置10min，于13000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min；

4)取上清，加入600μL冰乙醇，于13000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，倒掉上清，用75％乙醇沖洗沉淀；重復(fù)該步驟至少1次；

5)于7500r/min轉(zhuǎn)速下空離心3min，用移液器吸去底部多余的液體，放于室溫自然干燥；

6)干燥后，加入適量的滅菌ddH₂O充分溶解，然后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝-0.050x+29.28，R²＝0.482。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增時(shí)，采用的熒光定量PCR體系為SYBR Green Real time PCR Master Mix Plus，具體為：Solution 5μL、10mM的正向引物0.25μL、10mM的下游引物0.25μL、cDNA 2.5μL、ddH₂O、2μL。

8.根據(jù)權(quán)利要求3或7所述的方法，其特征在于，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增時(shí)，采用的程序?yàn)椋?/p>

1)95℃60s；

2)95℃15s；

3)60℃60s；

循環(huán)2)～3)39次。

9.權(quán)利要求3～8任一項(xiàng)所述方法在檢測(cè)由Botryosphaeria dothidea引起的獼猴桃軟腐病上的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括對(duì)獼猴桃種苗檢疫、土壤病原菌檢測(cè)、獼猴桃軟腐病早期病害診斷以及Botryosphaeria dothidea的檢測(cè)和鑒定。