[發明專利]RT-PCR檢測獼猴桃潰瘍病原菌的引物及檢測方法

有效

• 申請號: 201810138696.2
• 申請日: 2018-02-10
• 公開（公告）號: CN108179206B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 胡容平;石軍;陳松;葉慧麗;陳慶東;林立金
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院植物保護研究所;綿陽市農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/38
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

1.一種實時熒光RT-PCR檢測獼猴桃潰瘍病原菌Pseudomonas syringae pv. actinidae的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物由正向引物和反向引物組成，所述正向引物為：5＇- CCGCTGTGATACAATTCGGC -3＇，如SEQ ID NO .1所示，所述反向引物為：5＇-CGCACATAAGACAACAGGCG -3＇，如SEQ ID NO .2所示；利用所述特異性引物進行實時熒光RT-PCR檢測比進行普通PCR檢測的靈敏度至少提高100倍。

2.一種包含權利要求1所述特異性引物的實時熒光RT-PCR檢測獼猴桃潰瘍病原菌Pseudomonas syringae pv. actinidae的試劑盒。

3.一種實時熒光RT-PCR檢測獼猴桃潰瘍病原菌Pseudomonas syringae pv. actinidae的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）將提取的獼猴桃潰瘍病原菌Pseudomonas syringae pv. actinidae標準品的DNA進行10倍梯度稀釋，得到梯度稀釋的獼猴桃潰瘍病原菌Pseudomonas syringae pv. actinidae的 DNA，以其為模板，以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子分別作為正向引物和反向引物進行實時熒光RT-PCR擴增，以模板濃度的Log值為縱坐標，以擴增得到的Ct值作為橫坐標，制作標準曲線；

（2）采用CTAB法從獼猴桃果品中提取DNA，并將其稀釋至步驟（1）所得標準曲線范圍內；以SEQ ID NO.1所示的DNA分子引物和SEQ ID NO.2所示的DNA分子引物進行實時熒光RT-PCR擴增，得Ct值，然后根據步驟（1）所得標準曲線計算出目標片段的拷貝數；進行實時熒光RT-PCR擴增時，采用的熒光定量PCR體系為SYBR Green Real time PCR Master Mix Plus，具體為：Solution 5 μL、10 mM的正向引物0.25 μL、10 mM的下游引物0.25 μL、cDNA 2.5 μL、ddH₂O 2 μL。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述CTAB法的步驟為：

1）取適量的獼猴桃果品放入1.5 ml EP管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；

2）加入550 μL經65 ℃預熱的CTAB提取液，劇烈振蕩后，放于65 ℃恒溫箱中1 h，其間每間隔10 min振蕩混勻一次；

3）加入550 μL氯仿-異戊醇（24:1 v/v），劇烈震蕩并充分混勻，靜置10 min，于13000r/min轉速下離心5 min；

4）取上清，加入600 μL冰乙醇，于13000 r/min轉速下離心5 min，倒掉上清，用75 %乙醇沖洗沉淀；重復該步驟至少1次；

5）于7500 r/min轉速下空離心3 min，用移液器吸去底部多余的液體，放于室溫自然干燥；

6）干燥后，加入適量的滅菌ddH₂O充分溶解，然后保存于-20 ℃備用。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述標準曲線為：y = -0.1954x + 27.809；R² = 0.9104。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，進行實時熒光RT-PCR擴增時，采用的程序為：

1）95 ℃ 60s；

2）95 ℃ 15s；

3）60 ℃ 60 s；

循環2）~3）操作39次。