[發明專利]基于CRISPR-Cas9技術提高B16F10細胞轉染效率的方法

在審

• 申請號: 201810137912.1
• 申請日: 2018-02-10
• 公開（公告）號: CN108559745A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 楊佳麗;楊興林;潘謳東
• 申請（專利權）人: 和元生物技術（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了基于CRISPR?Cas9技術提高B16F10細胞轉染效率的方法。本發明首先獲得特異性靶向SQSTM1基因第二外顯子的sgRNA序列；其次構建SQSTM1基因的sgRNA到慢病毒載體系統，該載體表達Cas9蛋白；最后將含有該sgRNA的CRISPR/Cas9慢病毒載體轉染B16F10細胞，藥篩后獲得SQSTM1的敲除細胞株。轉染GFP質粒實驗發現，所獲得的SQSTM1的B16F10敲除細胞株具有轉染效率明顯高于未敲除細胞的優勢。本發明具有操作步驟簡單、sgRNA靶向性好，且對SQSTM1基因切割效率高；并能明顯提高B16F10細胞的轉染效率，為基礎研究提供更好的細胞工具。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，更具體地說涉及基于CRISPR-Cas9技術提高B16F10細胞轉染效率的方法。

背景技術

轉染是將外源核酸（包含：質粒，siRNA等）導入真核細胞中并發揮其功能的一種技術。目前轉染被廣泛應用于生物研究當中。然而許多生物學功能研究和涉及基因治療的多種藥物治療受限于細胞的轉染效率。

B16F10細胞是一種小鼠黑色素瘤細胞株，易于培養；目前被用于小鼠體外Cas9gRNA活性驗證，但目前該細胞轉染效率不高，常用lipo2000脂轉效率在10%左右，大大限制了后續gRNA活性驗證的檢測。

細胞內吞作用是調節細胞攝取質粒DNA的關鍵過程。重要的是，內吞作用可以促進誘導自噬作為細胞對胞外DNAs進入細胞而產生的防御機制。最近的報告顯示，一些轉染試劑，如磷酸鈣沉淀（CPPs）和脂質體（陽離子脂質），用于基因傳遞誘導自噬。研究顯示耗盡或敲除SQSTM1可以大大提高小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）和胚胎干（ES）細胞和人宮頸癌（Hela）細胞的基因傳遞效率。這些數據提示敲除SQSTM1可能有助于建立新的方法提高哺乳動物細胞基因傳遞效率。

為了更好的提高難轉染的B16F10細胞基因傳遞效率，本研究采用CRISPR/Cas9系統，通過設計針對SQSTM1基因序列的sgRNA片段，構建慢病毒sgRNA表達載體，從而特異性的靶向敲除SQSTM1基因。

參考文獻

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發明內容

本發明的首要目的在于提供一種靶向敲除SQSTM1基因的sgRNA慢病毒載體。

本發明的另一目的在于提供靶向敲除SQSTM1基因的小鼠黑色素瘤細胞B16F10細胞的應用，提高B16F10細胞轉染效率。