[發明專利]基于CRISPR-Cas9技術提高B16F10細胞轉染效率的方法在審
| 申請號： | 201810137912.1 | 申請日： | 2018-02-10 |
| 公開（公告）號： | CN108559745A | 公開（公告）日： | 2018-09-21 |
| 發明（設計）人： | 楊佳麗;楊興林;潘謳東 | 申請（專利權）人： | 和元生物技術（上海）股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/113 | 分類號： | C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 201321 上海市浦東*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 敲除 細胞 細胞轉染 轉染效率 細胞株 轉染 基因 慢病毒載體系統 慢病毒載體 特異性靶向 基礎研究 切割效率 載體表達 靶向性 外顯子 構建 藥篩 質粒 蛋白 發現 | ||
1.基于CRISPR-Cas9提高B16F10細胞轉染效率的方法，其特征在于，首先設計獲得特異性靶向SQSTM1基因第二外顯子的sgRNA；其次構建SQSTM1基因的sgRNA到慢病毒載體；然后將此慢病毒載體轉染B16F10細胞，藥篩后得到SQSTM1基因敲除細胞株。
2.根據權利要求1所述的特異性靶向SQSTM1基因第二外顯子的sgRNA，其DNA 序列如SEQ ID NO.1所示，所述sgRNA 在SQSTM1基因上的靶序列是唯一的。
3.根據權利要求2所述的特異性靶向SQSTM1基因第二外顯子的sgRNA，其引物包括：
針對SQSTM1基因的靶點位于第二外顯子上的引物對：
SQSTM1 sgRNA oligo1：如SEQ ID NO.2所示；
SQSTM1 sgRNA oligo2：如SEQ ID NO.3所示。
4.根據權利要求1所述的構建SQSTM1基因的sgRNA到慢病毒載體，是一種靶向敲除SQSTM1基因的CRISPR-Cas9 重組表達慢病毒載體pLenti-U6-SQSTM1spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9，其特征在于：含有特異性靶向SQSTM1基因第二外顯子的sgRNA 和Cas9 蛋白的重組表達載體。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體的骨架載體的序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；
根據權利要求1所述的CRISPR-Cas9 靶向敲除B16F10細胞SQSTM1基因及其特異性的sgRNA，其特征在于包括如下步驟：
(1) 提供sgRNA，所述sgRNA 在SQSTM1基因上的靶序列符合5’-N(19)G 的序列排列規則，所述sgRNA在SQSTM1基因上的靶序列位于基因的外顯子，所述sgRNA在SQSTM1基因上的靶序列位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上，所述sgRNA在SQSTM1基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA在SQSTM1上的靶位點序列如序列表SEQ ID NO.1序列所示，在所述sgRNA在SQSTM1上的靶位點序列的5’-端加上ACCG序列合成得到正向寡核苷酸即Forwardoligo ；獲得sgRNA 在SQSTM1上的靶位點序列的互補鏈，并且在互補鏈的5’-端加上AAAC序列得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ；將合成的1 對互補的sgRNA 寡聚核苷酸的Forward oligo 和Reverse oligo 成對變性、退火，退火之后形成可以連入包含U6啟動子的慢病毒表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸；
(2)線性化序列如序列表SEQ ID NO.8 所示的pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9質粒；將退火的雙鏈sgRNA 寡聚核苷酸與線性化的載體pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9連接獲得攜帶含相應靶序列的sgRNA 寡聚核苷酸的表達載體pLenti-U6-SQSTM1spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9質粒，轉化感受態細菌并涂Amp+ 平板，挑取單克隆并用通用引物U6 通過測序鑒定出陽性克隆，并對所述陽性克隆搖菌、提取質粒；
(3)用所述攜帶有sgRNA 寡聚核苷酸和Cas9 基因的序列為SEQ ID NO.9的表達載體pLenti-U6-SQSTM1spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9質粒轉染B16F10細胞；
(4)使用所述質粒轉染小鼠B16F10細胞，轉染48小時后用2ug/ml嘌呤霉素（puromycin）進行篩選后，進一步培養得到混合克隆；
(5)鋪單克隆細胞，并進一步放大培養；收集單克隆細胞，以其基因組DNA 為模板擴增包含所述靶序列的基因片段，TA克隆測序確認SQSTM1基因已經被敲除并獲得基因敲除的細胞。
6.根據權利要求1所述的敲除SQSTM1基因的細胞株，為B16F10細胞；其特征在于：是B16F10細胞中的SQSTM1基因缺失或插入核苷酸得到的細胞株，為如下的細胞株：sgRNA的切割后，導致SQSTM1基因的第二號外顯子增加126個堿基；經過比對，蛋白翻譯提前終止。
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