[發明專利]一種制備埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌及應用

在審

• 申請號: 201810137429.3
• 申請日: 2018-02-10
• 公開（公告）號: CN108342348A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 黃弋;袁志明;朱友杰;楊夢詩
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P21/02;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明公開了一種制備埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌及應用，誘導基因工程菌株Escherichia coli Bl21(DE3)/ pET?28a? ZEBOV?NP表達埃博拉病毒核蛋白，通過離心和超聲破碎獲得抗原，該抗原可溶性強，有良好的抗原性，適合作為間接ELISA檢測用抗原。本發明涉及的埃博拉病毒核蛋白抗原制備方法簡便快速，產量大，與經典制備方法相比，所獲抗原性質更穩定，所建立的間接ELISA檢測方法靈敏度強，特異性好，檢測周期短，有廣泛應用。

技術領域

本發明屬于病原檢測技術領域，具體涉及一種制備埃博拉病毒核蛋白抗原的基因工程菌及應用，利用本發明提供的工程菌，可大量快速地制備埃博拉病毒核蛋白抗原，該抗原能與相應抗體特異性的結合，該抗原在用于埃博拉病毒核蛋白抗體的檢測中具有很強的靈敏度和顯著的特異性，具有開發成為檢測試劑盒的應用價值。

背景技術

埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)能夠引起埃博拉出血熱，主要癥狀表現為發熱、腹瀉、體內外大出血等，主要通過體液、粘膜接觸傳播，氣溶膠傳播等，傳播能力極強，致死率極高，且尚無被批準上市的治療藥物和疫苗，因此被WHO定義為生物安全四級病毒。該病90％以上的流行發生在非洲赤道附近區域，在美洲及亞洲也有個別輸入型案例的報道。2014年至2016年，肆虐西非國家幾內亞、利比里亞、塞拉利昂的埃博拉病毒蔓延速度驚人，感染和死亡人數均為有記錄以來最多的一次疫情，成為國際高度關注的突發公共衛生事件，并對他國家的公共健康構成威脅。盡管到目前為止，埃博拉疫情主要發生在非洲，但是隨著經濟全球化進程的深入，中國和非洲經濟文化聯系的日益密切，大量人員頻繁來往于中非之間，埃博拉病毒對人們的威脅與日俱增，埃博拉疫情對中國的公共衛生體系建設和埃博拉疫情的防控帶來嚴峻的挑戰和威脅，因此需要對此類病毒的入侵做好儲備性工作，其中埃博拉病毒的血清學診斷技術的建立和完善是對埃博拉病毒進行有效防控的重要措施之一。

間接ELISA的原理是將已知的抗原吸附在固相載體表面，利用抗原抗體的特異性反應，使用酶標記的抗抗體檢測已與固相結合的受檢抗體，是傳染病特異性抗體檢測的常用方法之一，具有快速、靈敏、簡便、易于標準化等優點。同時，由于抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間，兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，因此ELISA檢測方法具有高度特異性。

作為埃博拉病毒抗體檢測的主要方法，國內外已建立多種ELISA檢測方法，但是抗原的選擇和制備方法會直接導致ELISA檢測方法的特異性、靈敏度及其操作的便利性有很大差異。在以往的ELISA檢測方法中，有的抗原來自于病毒感染的細胞培養物，雖然這類方法具備較好的特異性和靈敏度，但是由于埃博拉病毒為生物安全四級病毒，此類抗原的制備和使用需要在BSL-4實驗室中進行，使得該檢測方法風險高，效率低，在沒有BSL-4實驗室的條件下無法開展檢測工作(Ksiazek et al.,1999)。因此，很多研究人員選擇使用體外重組表達抗原建立ELISA檢測方法，結果均顯示能對埃博拉病毒感染病人恢復期血清或感染動物血清中的IgG抗體進行檢測(Prehaud et al.,1998；Saijo et al.,2001；Ikegami etal.,2003；Nakayamaet al.,2010)。但是，選擇不同靶抗原建立的ELISA檢測方法其特異性有較大差別，Groen和Sobarzo等人的研究顯示，以埃博拉病毒VP35、VP40以及GP為抗原建立的ELISA檢測方法其靈敏度均遜于以埃博拉核蛋白NP為抗原建立的ELISA檢測結果(Groenet al.,2003；Sobarzo et al.,2012)。而且上述利用經典的原核表達系統和真核表達系統(包括桿狀病毒表達系統和哺乳動物細胞表達系統)制備抗原的研究中，雖然都取得了較好的檢測靈敏度和特異性，但存在蛋白表達量少，病毒培養過程繁瑣，細胞易污染等弊端，使大多制備方法，尤其是其中的純化過程，顯得比較復雜繁瑣，難以快速大量制備且抗原質量不易控制，例如，純化的抗原易發生沉淀，從而大大降低了其作為間接ELISA檢測抗原的使用效率和效果。此外，真核表達系統制備的抗原成本通常較高，這些因素無疑是埃博拉病毒抗體間接ELISA檢測便捷地廣泛使用的障礙。

發明內容