[發(fā)明專利]一種利用熒光比率進行外泌體快速定量的方法

有效

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• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108169199B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設計）人: 肖義;李寧;張新富;陳令成
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司 21208
• 代理人: 楊翠翠

一種利用熒光比率進行外泌體快速定量的方法，其屬于熒光檢測的技術領域。該方法涉及到兩種熒光染料，染料A是一種高度水溶性并且對膜結構沒有親和性的染料，作為實驗過程中的內(nèi)參。染料B是一種特異性免洗的膜染料，染料B可以與親脂性的膜結構結合后會表現(xiàn)出強烈的發(fā)光性質(zhì),而在沒有與親脂性的膜結構結合的水環(huán)境中由于其疏水性而發(fā)生聚集而無熒光。本發(fā)明提供一種外泌體快速定量的方法，基于兩種熒光染料的比率定量，成功實現(xiàn)了生物樣品中外泌體的測定。該方法具有效率高，成本低，操作方便，測定結果準確性高等優(yōu)點。有望在外泌體相關研究中得到廣泛的應用。該方法應用于細胞培養(yǎng)基、唾液、血清、尿液、乳液。

技術領域

本發(fā)明具體涉及一種利用熒光比率進行外泌體快速定量的方法，其屬于熒光檢測的技術領域。

背景技術

外泌體是細胞經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”過程而形成的細胞外小囊泡。直徑為30～150nm的脂質(zhì)雙分子層結構囊泡。它作為一種重要的細胞間信息傳遞分子及遺傳物質(zhì)傳遞載體，外泌體內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)，廣泛分布于人體血液、尿液、唾液等體液中以及腫瘤細胞培養(yǎng)液中。腫瘤細胞分泌的外泌體可以促進腫瘤血管生成，也可以通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境來影響腫瘤的生長與轉移，外泌體在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在外泌體相關研究中，對分離純化的外泌體進行快速準確定量顯的非常重要。

目前對外泌體定量的方法主要有通過測外泌體總蛋白含量來定量外泌體的BCA蛋白定量法和借助納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)進行外泌體定量以及借助于外泌體膜上的標志性蛋白如CD63,CD9類四跨膜蛋白進行的蛋白免疫定量。外泌體的BCA蛋白定量法首先需要把分離純化的外泌體進行裂解，讓外泌體內(nèi)含有的全部蛋白以及膜上的蛋白釋放出來，二價銅離子在堿性的條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子，一價銅離子和BCA工作液相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應。兩分子的BCA工作液螯合一個銅離子，形成紫色的反應復合物。該復合物在560nm顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關系，根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度，從而得出外泌體的量。現(xiàn)階段分離純化外泌體的方法，主要有超速離心以及各種商業(yè)化試劑盒，得到的外泌體殘留有蛋白質(zhì)，尤其利用商業(yè)化試劑盒分離的外泌體殘留更多的蛋白，用此方法定量的外泌體的量不太準確。納米顆粒跟蹤分析(NTA)定量法是利用納米顆粒跟蹤分析技術可以實時地對懸浮液中的顆粒進行逐個的直接成像和觀察，并用視頻攝像機捕獲所產(chǎn)生的散射光。通過跟蹤單個顆粒在二維平面上的位置變化來確定顆粒的擴散情況。納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)可提供高分辨率的粒度分布圖表和粒子濃度信息。該定量方法的缺點是設備比較昂貴，實驗室通用性比較低。外泌體免疫定量方法主要包括蛋白免疫印跡(WB)，流式細胞法(FACS)以及商業(yè)化ELISA試劑盒。這種定量方法存在實驗操作繁瑣，實驗儀器昂貴等問題。并且常用的外泌體標志性蛋白相對含量在不同類型的外泌體中有所不同，所以外泌體的免疫定量法結果也不夠準確。綜上所述，快捷，準確，高效的外泌體定量方法有待開發(fā)。本專利中細胞培養(yǎng)基、唾液、血清、尿液、乳液等生物樣本中外泌體的分離純化采用超速離心的方法參考文獻報道(Nature，2015,523(7559),177-182)。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種借助于熒光比率進行外泌體快速定量的方法，此方法具有高效，準確度高，成本低和易操作等特點。

本發(fā)明采用的技術方案為：一種利用熒光比率進行外泌體快速定量的方法，包括以下步驟：

(1)配制染料母液

將染料A配制成100-200μM的DMSO的母液，將染料B配制成1-2mM的DMSO的母液；所述染料A為A-1、A-2或A-3，染料B為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6或B-7；

所述染料A和染料B的結構如下：

染料A：

染料B：