[發明專利]一種利用熒光比率進行外泌體快速定量的方法

有效

• 申請號: 201810136615.5
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108169199B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 肖義;李寧;張新富;陳令成
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司 21208
• 代理人: 楊翠翠

1.一種利用熒光比率進行外泌體快速定量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)配制染料母液

將染料A配制成100-200μM的DMSO的母液，將染料B配制成1-2mM的DMSO的母液；所述染料A為A-1、A-2或A-3，染料B為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6或B-7；

所述染料A和染料B的結構如下：

染料A：

染料B：

(2)標準曲線的制備

在10-50μg/μL的濃度范圍內，制備5-15份不同濃度的一系列外泌體標準液；向一系列外泌體標準液中加入染料A的母液和染料B的母液，使得染料A的濃度為100-200nM，染料B的濃度為1-2μM；混勻室溫下反應后，在相同波長激發下，測定染料A以及染料B的熒光光譜，以染料B與染料A最大發射處的熒光強度的比率值作為縱坐標，標準外泌體溶液的濃度作為橫坐標，制作標準曲線；

(3)待測外泌體樣品的濃度

向待測外泌體的樣品加入染料A的母液和染料B的母液，使得染料A的濃度為100-200nM，染料B的濃度為1-2μM；混勻室溫下反應后，測定染料A以及染料B的熒光光譜，得到染料B與染料A最大發射處的熒光強度的比率值，帶入標準曲線方程，得到待測外泌體樣品的濃度。

2.根據權利要求1所述的一種利用熒光比率進行外泌體快速定量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)熒光染料母液的配制

染料A母液的配制：配制染料A-1的DMSO母液100μM，

染料B母液的配制：配制染料B-1的DMSO母液1mM，

(2)標準曲線的制備

分別取外泌體標準液0、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250μL，依次配成濃度為0、4.52、9.04、13.56、18.07、22.59、27.10、31.62、36.14、40.66、45.18μg/μL外泌體標準液；分別加入染料A-1母液，使染料A-1溶液的濃度為100nM；加入染料B-1母液，使染料B-1溶液的濃度為1μM；震蕩均勻后室溫下反應10min，測定染料A-1和染料B-1的熒光光譜；染料B-1在615nm處的的熒光強度與染料A-1在584nm處的熒光強度的比率值作為縱坐標，外泌體標準液濃度作為橫坐標制作標準曲線，得到標準曲線方程為：y＝0.0315x+0.4824，R²＝0.965,其中x為10-50μg/μL；

(3)外泌體樣品的測定

取待測外泌體樣品，依次加入染料A-1母液，使染料A-1溶液的濃度為100nM；加入染料B-1母液，使染料B-1溶液的濃度為1μM；震蕩均勻后室溫下反應10min,測定染料A-1和染料B-1的熒光光譜；計算出染料B-1在615nm處的的熒光強度與染料A-1在584nm處的熒光強度的比率值，根據熒比率值帶入標準曲線得到待測外泌體樣品的濃度。

3.根據權利要求1所述的一種利用熒光比率進行外泌體快速定量的方法，其特征在于：該方法應用于細胞培養基、唾液、血清、尿液、乳液。