[發(fā)明專利]一種無糖基化抗PD-1單克隆抗體的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810135757.X
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN110128537B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張貴民;趙麗麗;劉增田
• 申請（專利權(quán)）人: 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K1/22
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本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及到蛋白純化技術(shù)，具體公開了一種無糖基化抗PD?1單克隆抗體的純化方法。親和層析過程中，引入鹽成分，能夠顯著地改善親和層析性能，降低蛋白濁度。洗滌和洗脫過程引入甘氨酸?鹽酸緩沖液，可有效減少聚體產(chǎn)生，增加蛋白穩(wěn)定性。在病毒滅活過程中，加入了糖類物質(zhì)，起到保護(hù)作用從而減少聚體形成，使抗體在低pH滅活下聚體增加變緩。本發(fā)明很好的減少了無糖基化抗pd?1單克隆抗體純化過程中聚體的形成，保護(hù)了蛋白的穩(wěn)定性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及到單克隆抗體純化技術(shù)，具體涉及到一種無糖基化抗PD-1單克隆抗體的純化方法。

背景技術(shù)

PD-1是一種免疫抑制劑性受體，主要在激活的T細(xì)胞及B細(xì)胞中，功能是抑制細(xì)胞激活，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，PD-1的配體PDL-1與PDL-2高表達(dá)于腫瘤微環(huán)境中，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境PD-1通路持續(xù)激活，T細(xì)胞功能被抑制，無法殺傷腫瘤細(xì)胞；同時PD-1的信號傳導(dǎo)可以抑制B細(xì)胞增殖、分化Ig類型轉(zhuǎn)換，在建立和維護(hù)外周自身耐受中起重要作用。

抗PD-1單抗是針對PD-1的一種抗體蛋白，該抗體能特異性地與PD-1結(jié)合，阻斷PDL-1與PD-1相結(jié)合部分，恢復(fù)T細(xì)胞功能，對腫瘤生長具有顯著抑制作用，在治療腫瘤方面具有很好的靶向潛能。針對這一優(yōu)勢，開發(fā)研制了一種重組人源化抗PD-1單克隆抗體，其上糖基化修飾被敲除。過去多年的抗體研究都強調(diào)糖基化對抗體功能的重要性，但帶糖基化的抗體免疫原性和蛋白折疊凳也會存在很多不確定性，增加了工藝開發(fā)的難度。目前部分研究者發(fā)現(xiàn)無糖基化后的抗體開發(fā)比較穩(wěn)定，均一性提高，且能降低抗體在體內(nèi)引起的炎癥及細(xì)胞毒性，同時抗體的Fc片段更靈活，更易與FcyRs結(jié)合。然而構(gòu)建的無糖基化的抗PD-1單克隆抗體由于去除糖基化而對胰蛋白酶等的敏感性顯著增加，結(jié)構(gòu)靈活性增強，在低pH情況下更容易有聚體形成的趨勢，易聚集沉淀，急需一種純化方法來解決蛋白聚集問題。

從重組表達(dá)的宿主中提取單克隆抗體，柱層析是關(guān)鍵。結(jié)合在柱上的蛋白可以通過調(diào)節(jié)流動相的類型、pH和濃度來被洗脫下來，在這些過程中，存在蛋白濃度或表面密度過高的情況，從而導(dǎo)致聚體形成以及蛋白的異質(zhì)性。層析中的親和層析通常有很高的配基密度高，更易在柱表面或柱上部形成高蛋白密度，且親和層析通常用于粗純對回收率要求較高，洗脫pH較低，蛋白易沉淀，更易產(chǎn)生聚體，故更需在純化過程中減少聚體的產(chǎn)生，提高蛋白穩(wěn)定性。抗體純化過程中病毒滅活多采用低pH病毒滅活，在低pH條件下，目的蛋白容易產(chǎn)生聚體，這些聚體的產(chǎn)生大大威脅了抗體的穩(wěn)定性，對臨床用藥也存在潛在威脅，因此很有必要提供一種抗體純化方法來減少這些聚體的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種可有效減少聚體產(chǎn)生的無糖基化抗PD-1單克隆抗體的純化方法，該方法可有效減少聚體產(chǎn)生，提高抗PD-1單抗的穩(wěn)定性和回收率。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種無糖基化抗PD-1單克隆抗體的純化方法，包括親和層析和病毒滅活步驟。

優(yōu)選地，該方法具體包括如下步驟：

(1)對細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行親和層析：平衡、上樣、洗滌、洗脫過程；

(2)收集步驟(1)洗脫流出液加入糖類物質(zhì)，攪拌至完全溶解；

(3)將步驟(2)所得樣品調(diào)pH進(jìn)行低pH病毒滅活。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中親和層析過程，平衡過程采用緩沖液平衡，緩沖液為含鹽的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉的緩沖液(0.02mol/L，pH7.0～7.4)；洗滌過程包括三步，第一步平衡緩沖液復(fù)平衡，第二步所用的洗滌緩沖液為含鹽的Tris-鹽酸緩沖液(0.02mol/L，pH8.0～8.5)；第三步洗滌所用的洗滌緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液(0.02mol/L，pH4.5～5.5)；洗脫緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液(0.02mol/L，pH2.7～3.1)。