[發明專利]小麥黃條紋病毒及其NASH檢測方法、檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201810135714.1
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108315337B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 劉艷;杜真真;王錫鋒
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12Q1/70;C12Q1/6811;C12Q1/6834;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

1.小麥黃條紋病毒（Wheat yellow striate virus, WYSV）基因組序列，該序列如SEQID NO.3所示。

2.一種用于權利要求1所述小麥黃條紋病毒（Wheat yellow striate virus, WYSV）的核酸斑點雜交檢測方法，包括如下步驟：

（1）重組質粒的獲得：所述的重組質粒是含WYSV部分基因目的片段的pMD -18T重組載體；所述的重組載體是通過WYSV特異性引物對以反轉錄PCR擴增獲得的PCR產物，純化后連接至pMD -18T載體上，轉化至DH 5α大腸桿菌感受態中；所述WYSV特異性引物對為：

SEQ ID NO.1：5’ ggtgctcagtgtcgctttct -3’；

SEQ ID NO.2：5’ acctgctgttccattcttgtc -3；

（2）地高辛標記探針的制備：所述探針為以地高辛為標記物通過PCR法制得的DNA探針，所述制備探針的PCR體系中總體積25 μL，其中0.5 μL重組質粒、2 μL濃度為2.5 mM的DIG-dNTPs、0.2 μL rTaq以及濃度為10 μmol/L的WYSV特異性引物對各0.5μL，

在制備探針的PCR體系反應液中，包含有如下一對特異性引物對，其核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：5’ ggtgctcagtgtcgctttct -3’；

SEQ ID NO.2：5’ acctgctgttccattcttgtc -3’；

（3）通過點樣和雜交進行NASH檢測：

將待測總RNA樣品點于硝酸纖維素尼龍膜上，加入雜交緩沖液進行預雜交；將步驟（2）中制備的地高辛標記探針加入雜交緩沖液中雜交，再免疫顯色。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，所述步驟（1）中PCR擴增反應條件為：94℃ 3 min，94℃ 30 s、56℃ 45 s 和72℃90 s共35 個循環，72℃ 10 min。

4.權利要求2－3任一所述的檢測方法在檢測感病農作物植株體內WYSV病毒中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，所述農作物為小麥，大麥或燕麥。

6.一種用于檢測 WYSV病毒的試劑盒，該試劑盒包括有： PCR體系反應液、NASH反應試劑、硝酸纖維素膜和雜交袋；所述的NASH反應試劑由以下組分組成：

SDS： 10%w/v

封閉液： 封閉劑用Buffer1稀釋到10%

洗滌液： Buffer1+0.3%w/v Tween-20

Buffer 1: 0.1M Maleic acid，0.15M NaCl，pH7.5

Buffer 2: 將封閉液用Buffer 1稀釋10倍

Buffer 3: 100mMTris-HCl，100mMNaCl，pH9.5

Buffer 4: 10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0

NBI/CBIP: 10mL

顯色底物溶液: 200μL NBT/BCIP加入10mL Buffer3中

雜交緩沖液： 5×SSC，2%w/v封閉液，0.02%w/v SDS, 0.1%w/v N-lauroylsarcosine, 50%甲酰胺

AP-DIG抗體: 50μL

20×SSC溶液： 3MNaCl，0.3M Na-citrate, pH7.0，實驗中所需的0.5×SSC、2×SSC、5×SSC溶液由20×SSC做相應稀釋；

所述PCR體系反應液中含WYSV特異性引物對，其序列如下：

SEQ ID NO.1：5’ ggtgctcagtgtcgctttct -3’；

SEQ ID NO.2：5’ acctgctgttccattcttgtc -3；

通過PCR體系反應得到地高辛標記探針。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，所述試劑盒中還包括WYSV陽性對照樣品和陰性對照樣品。