[發明專利]梅花鹿鑒定引物及方法和應用

在審

• 申請號: 201810132008.1
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108148916A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 蘇暢;王淑紅;關瀟瀅;王洋;刁璇;王鐵杰;魯藝
• 申請（專利權）人: 深圳市藥品檢驗研究院(深圳市醫療器械檢測中心)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

本發明涉及一種梅花鹿鑒定引物及方法和應用，屬于物種鑒定技術領域。該鑒定引物包括：內引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；內引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；環引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；環引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。該引物能夠特異性的快速擴增梅花鹿核酸，解決鹿茸在“真偽”鑒別上的瓶頸性難題。

技術領域

本發明涉及物種鑒定技術領域，特別是涉及一種梅花鹿鑒定引物及方法和應用。

背景技術

鹿茸是指梅花鹿的雄鹿未骨化而帶茸毛的幼角，是名貴藥材。鹿茸中含有磷脂、糖脂、膠脂、激素、脂肪酸、氨基酸、蛋白質及鈣、磷、鎂、鈉等成分，其中氨基酸成分占總成分的一半以上。李時珍在《本草綱目》上稱鹿茸“善于補腎壯陽、生精益血、補髓健骨”，為一種傳統的名貴中藥。

但是，目前市場上大量的鹿茸制品真偽不用，存在鑒別上的難題，亟需一種快捷、理想、可靠的標準化、規范化的鑒別方法。

2000年，Notomi等發明了環介導恒溫核酸擴增技術(loop-mediated isothermalamplification of DNA，LAMP)，可以在等溫條件下實現核酸擴增。LAMP技術的反應原理是，根據序列保守區域設計的一對外引物，一對內引物和一對環引物特異性識別靶序列上的六個獨立區域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60～67℃范圍60min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物白色的焦磷酸鎂沉淀產生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列六個獨立區域，所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，檢測時間大大縮短，而且快速敏感。目前，LAMP技術在細菌和病毒檢測、耐藥基因檢測、寄生蟲檢測、胎兒性別鑒定等方面被廣泛應用。

發明內容

基于此，有必要針對上述問題，提供一種梅花鹿鑒定引物及方法，采用該引物及方法，能夠快速檢梅花鹿核酸，為鹿茸等動物類藥材的標準化鑒定提供新的思路，解決鹿茸在“真偽”鑒別上的瓶頸性難題。

一種梅花鹿鑒定引物，包括以下引物：

內引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；

內引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；

外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；

外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；

環引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；

環引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。

上述引物，是發明人根據梅花鹿基因組的特點，經過反復實驗后得到，其中，核心區域F1(FIP后段)和LF被放置到梅花鹿特異插入片段，保證了該套引物的特異性。該套引物用于擴增非梅花鹿核酸時，由于缺失了該片段，擴增時，導致FIP引物不能形成環狀啞鈴狀結構，因此無法進行LAMP指數擴增，從而不能擴增非梅花鹿核酸。此外，環引物LF也位于特異性的插入片段，僅僅只有當擴增梅花鹿核酸時才能進行加速擴增，進一步保證了特異性。

在其中一個實施例中，所述內引物FIP和BIP的工作濃度為35-45pmol，所述外引物F3和B3的工作濃度為8-12pmol，所述環引物LF和LB的工作濃度為16-24pmol。采用上述濃度配比，具有較好的擴增效率。

本發明還公開了一種梅花鹿鑒定方法，包括以下步驟：