[發(fā)明專利]梅花鹿鑒定引物及方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810132008.1
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108148916A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發(fā)明（設計）人: 蘇暢;王淑紅;關瀟瀅;王洋;刁璇;王鐵杰;魯藝
• 申請（專利權）人: 深圳市藥品檢驗研究院(深圳市醫(yī)療器械檢測中心)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)海心聯(lián)合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

1.一種梅花鹿鑒定引物，其特征在于，包括以下引物：

內引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；

內引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；

外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；

外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；

環(huán)引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；

環(huán)引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。

2.根據(jù)權利要求1所述的梅花鹿鑒定引物，其特征在于，所述內引物FIP和BIP的工作濃度為35-45pmol，所述外引物F3和B3的工作濃度為8-12pmol，所述環(huán)引物LF和LB的工作濃度為16-24pmol。

3.一種梅花鹿鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

環(huán)介導恒溫核酸擴增：采用權利要求1-2任一項所述的引物對待測樣品的基因組進行擴增；

判定：通過測定反應液的濁度，濁度上升為陽性反應，即該樣品為梅花鹿樣品，濁度無變化為陰性反應，即該樣品為非梅花鹿樣品；

和/或

往反應液中加入鈣黃綠素指示劑，反應液為綠色為陽性反應，即該樣品為梅花鹿樣品，反應液橙色為陰性反應，即該樣品為非梅花鹿樣品。

4.根據(jù)權利要求3所述的梅花鹿鑒定方法，其特征在于，所述環(huán)介導恒溫核酸擴增步驟中，擴增反應體系為25μl，包括如下組分：待測物的基因組DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜堿，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase；

引物加入量為：40pmol內引物FIP和內引物BIP，20pmol環(huán)引物LF和環(huán)引物LB，5pmol外引物F3和外引物B3。

5.根據(jù)權利要求3所述的梅花鹿鑒定方法，其特征在于，所述環(huán)介導恒溫核酸擴增步驟中，擴增反應的溫度為60-62℃，擴增反應的時間為60-70min。

6.根據(jù)權利要求3所述的梅花鹿鑒定方法，其特征在于，所述判定步驟中，鈣黃綠素指示劑的添加量為1μl，包含有0.5mM鈣黃綠素和10mM氯化錳。

7.權利要求1所述的梅花鹿鑒定引物在鑒定梅花鹿品種中的應用。

8.一種梅花鹿鑒定試劑盒，其特征在于包括權利要求1所述的引物。

9.根據(jù)權利要求8所述的梅花鹿鑒定試劑盒，其特征在于，還包括DNA提取試劑、環(huán)介導恒溫核酸擴增試劑、顯色指示劑和緩沖溶液中的至少一種。

10.根據(jù)權利要求9所述的梅花鹿鑒定試劑盒，其特征在于，還包括陽性對照試劑和陰性對照試劑。