[發明專利]一種去除無細胞百日咳組分疫苗中內毒素的方法

在審

• 申請號: 201810131774.6
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108676829A
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 孫明波;梁疆莉;高娜;顧琴;姬秋彥;馬艷;李琦涵;史茘;楊凈思;姚宇峰;楊曉蕾;車艷春;衡燮;和占龍;趙剛
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K1/18;C07K1/14;C12R1/01
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 鄭俊彥;許文娟

本發明提供了一種去除無細胞百日咳組分疫苗中內毒素的方法，所述方法利用新型復合型陰離子層析填料Capto adhere，通過層析純化去除百日咳毒素(Pertussistoxin，PT)和絲狀血凝素(Filamentous hemagglutinin，FHA)中的內毒素。所述方法可以在不帶入外源物質的前提下，保持有效成分PT和FHA生物活性和回收率的同時，將PT和FHA中的內毒素去除至100 EU/mg以下。所述填料Capto adhere在處理樣品時要求緩沖液的電導范圍較廣，減少了緩沖液置換的過程。相對于其它方法而言，在大批量制備PT和FHA時，使用Capto adhere層析介質去除內毒素是一種合理且高效的方法。

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，特別涉及一種去除無細胞百日咳組分疫苗中內毒素的方法。

背景技術

百日咳桿菌是百日咳的病原菌，嗜血桿菌屬，呈革蘭氏陰性，短桿狀或橢圓形，百日咳菌可產生外毒素和內毒素，以及其他許多抗原性的生物活性物質。其中內毒素產生于革蘭氏陰性菌的細胞外壁，是引起發熱等疫苗副反應的物質，新的抗原純化方法的改進使得內毒素的去除問題顯現出來，《英國藥典》聯合疫苗DTaP的內毒素要求為<100 EU/劑，未來國內的質量標準對內毒素的要求也不能低于該規定。因此，無細胞百日咳疫苗生產中應盡量降低內毒素含量，以保證高質量的疫苗生產和使用。

內毒素的本質是脂多糖，是熱源的活性部分，含3個不同的化學區：包括內層的引起毒性反應的類脂A區、中層的核心寡糖區和外層的特異性多糖鏈區。內毒素相對分子質量從幾千到幾萬不等，具有耐熱性和化學穩定性，性質極不均一，很難找到一種高效且通用的內毒素去除方法，將其一次性徹底去除，有的甚至經過多個步驟處理后，仍然達不到要求。尤其在生物制品生產過程中，需要有嚴格的工藝控制對內毒素進行去除或者限量控制。

百日咳組分疫苗的蛋白純化需要考慮內毒素的去除問題。有廠家使用比較經典的非離子表面活性劑，如TritonX等，來去除內毒素，實際使用時我們發現該方法雖然簡易，只需在純化過程中加入合適劑量的表面活性劑，但是同時會使疫苗中增加與抗原無關的多余成分，增加后期的檢定項目工作。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的是提供一種去除無細胞百日咳組分疫苗中內毒素的方法，并在去除內毒素的同時，能夠獲得較高的目標蛋白回收率。

本發明的目的是通過以下方案實現的：

一種去除無細胞百日咳組分疫苗中內毒素的方法，包括以下步驟：

1）將百日咳桿菌發酵液離心，收集上清液經0.45μm濾膜過濾，再經超濾濃縮得到發酵上清，用含尿素的磷酸平衡緩沖液調節發酵上清的pH和電導，調整后樣品上樣于Capto SPImpRes柱中，洗脫并分別收集PT組分和FHA組分；

2）將步驟1）得到的PT組分繼續上樣于Capto MMC柱，洗脫得到進一步純化后的PT組分；

3）用含尿素的磷酸平衡緩沖液調節步驟2）收集的進一步純化后的PT組分和步驟1）收集的FHA組分的pH和電導，而后分別上樣于Captoadhere柱中洗脫，通過層析純化去除內毒素，收集樣品穿透峰，即得到目的蛋白PT和FHA。

進一步的，所述含尿素的磷酸平衡緩沖液為尿素濃度為1.5~2.5 mol/L的磷酸平衡緩沖液。

進一步的，步驟1）中所述發酵上清上樣前調至pH5.0~6.0、電導<8ms/cm。

進一步的，步驟1）中所述的洗脫是分別用含0.11 mol/L、0.15 mol/L和0.35 mol/L NaCl 的洗脫液洗脫。

進一步的，步驟2）中所述的洗脫是用Tris-HCl緩沖液進行洗脫。