[發明專利]一種原野庫蠓的特異基因及其分子鑒定方法

在審

• 申請號: 201810130954.2
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108342398A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 陳海嬰;劉仰青;陶卉英;馬紅梅;柳小青
• 申請（專利權）人: 南昌市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/11;C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 覃婧嬋

1.一種原野庫蠓特異基因，其特征在于，所述基因為COI基因，其具有如SEQ ID No.1所示的序列。

2.權利要求1所述的庫蠓的COI基因的PCR引物。

3.權利要求2所述的庫蠓的COI基因的PCR引物，其特征在于，優選的，PCR引物序列分別為：

正向引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’

反向引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

4.一種原野庫蠓的分子鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

4.1 從待測的庫蠓組織中分離提取DNA；

4.2 以該DNA為模板，對COI基因采用的引物為：

正向引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，

反向引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出原野庫蠓COI基因；

4.3 取適量步驟4.2擴增后的COI基因產物用瓊脂糖電泳分離，經溴乙錠染色后在凝膠成像系統下觀察，根據擴增產物的大小判定結果，如果能特異性擴增出大小約為677bp的條帶，測序；

4.4 根據測序結果，如果相應COI基因序列與SEQID No.1的相似性在98％以上，即可判斷所述的待測昆蟲組織為原野庫蠓。

5.一種原野庫蠓的分子鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

5.1.標本的采集與保存

現場采用燈誘法，晚掛晨收進行誘集，采獲得標本經冷凍處死后直接保存于95％酒精中；

5.2.DNA模板的制備

采用小型昆蟲微量DNA模板制備方法提取原野庫蠓DNA，提取的DNA樣品保存于-20℃備用；

5.3.目的基因序列的獲取

引物合成：以獲得的未知庫蠓DNA為模板，合成引物，所用引物序列如下：

正向引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’

反向引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’

PCR擴增：PCR反應50μL體系如下：模板5μL、正向引物和反向引物混合2.5μL、2×PCRMaster Mix 25μL、ddH2O 17.5μL；PCR產物保存于4℃備用；

5.4 PCR擴增產物檢測與基因序列測定

取5μLPCR擴增產物，用1％的瓊脂糖凝膠電泳，150V電壓，75mA電流，30min；溴乙錠染色，凝膠成像系統檢測，如果特異性擴增出大小約為677bp的產物，測序，結果顯示與基因序列SEQ ID No.1的相似性為99.9％，則可判定為原野庫蠓。