[發明專利]一種用傳代細胞系懸浮培養傳染性支氣管炎病毒的方法

有效

• 申請號: 201810129825.1
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108300704B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 李延鵬;陳瑞愛;羅順;蔡仕君;溫良海;羅瓊;張曉楠
• 申請（專利權）人: 華農（肇慶）生物產業技術研究院有限公司;華南農業大學;肇慶大華農生物藥品有限公司;甘肅健順生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚;付靜

本發明提供了一種用傳代細胞系懸浮培養傳染性支氣管炎病毒的方法，包括：步驟1：取EB66細胞進行復蘇與傳代培養；步驟2：對步驟1所得EB66細胞進行雞傳染性支氣管炎病毒的接種培養；步驟3：接毒后的EB66細胞每隔6?12h進行取樣，測定病毒的EID50，在病毒EID50達到最高時收獲病毒并保存，得到培養后的雞傳染性支氣管炎病毒。本發明采用EB66細胞作為雞傳染性支氣管炎病毒的培養基質，利用提供用全懸浮傳代細胞系EB66細胞進行高效的病毒生產，有效提高支氣管炎病毒的培育滴度，從而為實現雞傳染性支氣管炎病毒疫苗的大規模培養，降低病毒的培育成本。

技術領域

本發明涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒的全懸浮培養方法，特別涉及一種使用傳代細胞系進行全懸浮培養雞傳染性支氣管炎病毒的方法，屬于獸用生物制品技術領域。

背景技術

雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)作為一種急性、高度接觸性的病毒性傳染病，主要由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的，該病廣泛流行于世界各地，是嚴重危害世界養禽業的重大傳染病之一，被世界動物衛生組織(OIE)列為B類疫病。該病主要侵害雞的呼吸系統、泌尿系統和消化系統，表現出廣泛的組織嗜性和高度的遺傳變異性，可導致不同日齡、性別和品種的雞只發生不同程度的疾病，且死亡率較高。此外，IBV還可侵害雞的腎臟、生殖道、腸道、肌肉等器官，導致雞只增重和飼料報酬率降低、產蛋雞的產蛋量及產蛋品質下降，給養雞業的生產帶來巨大損失。

迄今為止，防治本病多采用弱毒株IB H120和IB H52生產雞胚組織弱毒苗及IBM41生產的雞胚組織滅活苗作為疫苗對雞傳染性支氣管炎進行防治。但目前，該疫苗的生產主要采用傳統的雞胚接種收獲尿囊液的方式，導致疫苗需要消耗大量SPF雞胚，具有生產周期長、易污染的缺點，且每枚SPF雞胚一次只能注射一個病毒毒株，在各類禽病大爆發的時候，該方法無法通過快速生產來滿足養禽業對于疫苗的需求。

細胞懸浮培養是一種利用生物反應器來大規模培養動物細胞、生產生物制品的核心技術，是當前國際上生物制品生產的主流模式，其最大優勢是通過更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產量的同時能穩步提高產品的質量。隨著現代生物技術發展，利用細胞懸浮培養技術進行生物制品生產是生物制藥行業發展的必然趨勢。目前，已有報道采用傳代細胞系Vero細胞系、BHK-21細胞系培養雞傳染性支氣管炎病毒，但都因培養的病毒滴度過低或無法實現大規模全懸浮培養而無法真正取代傳統的雞胚接種培養法。

發明內容

本發明提供了一種用傳代細胞系懸浮培養傳染性支氣管炎病毒的方法，提供用全懸浮傳代細胞系EB66細胞生產雞傳染性支氣管炎病毒的方法，有效提高支氣管炎病毒的培育滴度，從而為實現雞傳染性支氣管炎病毒疫苗的大規模培養。

本發明提供了一種用傳代細胞系懸浮培養傳染性支氣管炎病毒的方法，包括：

步驟1：取EB66細胞進行復蘇與傳代培養；

步驟2：對步驟1所得EB66細胞進行雞傳染性支氣管炎病毒的接

種培養；

步驟3：接毒后的EB66細胞每隔6-12h進行取樣，測定病毒的EID₅₀，在病毒ED₅₀達到最高時收獲病毒并保存，得到培養后的雞傳染性支氣管炎病毒。

進一步地，所述步驟2的雞傳染性支氣管炎病毒接種方法為二階培養法，所述步驟2的操作方式如下：待EB66細胞的密度培養生長至適于接毒時，進行雞傳染性支氣管炎病毒的接種，待接毒完成后，將EB66細胞放回具有5％CO₂的培養箱中進行吸附0.5h-2h，吸附完成后補加病毒生產液，并放回到5％CO₂培養箱中繼續培養。