[發明專利]一種用傳代細胞系懸浮培養傳染性支氣管炎病毒的方法

有效

• 申請號: 201810129825.1
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108300704B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 李延鵬;陳瑞愛;羅順;蔡仕君;溫良海;羅瓊;張曉楠
• 申請（專利權）人: 華農（肇慶）生物產業技術研究院有限公司;華南農業大學;肇慶大華農生物藥品有限公司;甘肅健順生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚;付靜

1.一種用傳代細胞系懸浮培養傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：

步驟1：取EB66細胞進行復蘇與傳代培養；

步驟2：待步驟l所得EB66細胞的密度培養生長至適于接毒時，采用二階培養法對進行雞傳染性支氣管炎病毒的接種，且傳染性支氣管炎病毒接毒量為0.001MOI-1MOI，待接毒完成后，將EB66細胞放回具有5％CO₂的培養箱中進行吸附0.5h-2h，吸附完成后補加病毒生產液，并放回到5％CO₂培養箱中繼續培養；

步驟3：接毒后的EB66細胞每隔6-12h進行取樣，測定病毒的EID₅₀，病毒EID₅₀達到最高時收獲病毒并保存，得到培養后的雞傳染性支氣管炎病毒；

步驟4：取步驟3所得培養后的傳染性支氣管炎病毒作為下一代病毒傳代培養的種毒，并繼續采用二階培養法，將病毒接種至EB66細胞中進行病毒的傳代馴化與增殖，并按此方法連續傳代2-30代，最終收獲傳染性支氣管炎病毒在EB66細胞系傳代細胞中的適應毒；

其中，步驟2中EB66細胞在接種病毒后還需要補加TPCK胰酶，補加策略為接種病毒后的第0天、第1天、第2天、第3天分別補加1mg/L的TPCK膜酶或接種病毒后的第0天一次性補加4mg/L的TPCK胰酶。

2.根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟l中EB66細胞復蘇與傳代培養方法如下：

從液氮中迅速取出鴨胚細胞衍生的傳代細胞，在37℃水浴鍋中迅速融化，待EB66細胞完全融化后，將復蘇細胞加入約復蘇細胞30倍體積的培養基中，經離心機以300g離心10min，倒掉上清液，加入培養基將細胞吹打重懸均勻，并接種至三角搖瓶中，并放置于軌道搖床上進行懸浮培養，每天取樣進行細胞計數并計算活率，待培養至第2-3天時，進行細胞傳代，細胞經連續傳代3代次以上，且細胞倍增速率穩定時，用于病毒的接種或者繼續傳代。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中EB66細胞培養溫度為35℃-37℃，培養轉速為130rpm-150rpm。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中EB66細胞的接種密度為6×10⁶/mL-15×10⁶/mL，此時，用于傳染性支氣管炎病毒的接種。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中細胞接毒后在5％CO₂的培養箱中培養，培養溫度為33℃-35℃；培養轉速為110rpm-140rpm。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述補加病毒生產培養基的補加比例為原工作培養基體積的1-3倍。