[發(fā)明專利]一種煙草根結(jié)線蟲病中三種主要病原線蟲的同步檢測(cè)鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810129683.9
• 申請(qǐng)日: 2018-02-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108300791B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李梅云;吳文濤;宋中邦;張靖;曾建敏;王揚(yáng);王丙武;焦芳嬋;高玉龍;吳興富;李永平;李文正
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 昆明知道專利事務(wù)所(特殊普通合伙企業(yè)) 53116
• 代理人: 姜開(kāi)俠;謝喬良

1.一種煙草根結(jié)線蟲病中三種主要病原線蟲的同步檢測(cè)鑒定方法，其特征在于，包括PCR引物設(shè)計(jì)、DNA模板制備、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)步驟，具體包括：

A、PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的種類特異性序列設(shè)計(jì)6條PCR引物，即TR1、TR2、TR3、TR4、TR5和TR6用于上述3種根結(jié)線蟲PCR鑒定，其序列分別為：

TR1：5'-AAGCAAAAGACGAAGCACCAAAA-3'

TR2：5'-GAGGATTCAGCTCCCCAGCAC-3'

TR3：5'-GAGTACGGATTTGAAATACAGGG-3'

TR4：5'-TGAATGCTATGCCATCAGGAG-3'

TR5：5'-CGATTGAACTGAGCCCAGACT-3'

TR6：5'-TTTATTCGCAAGACAACACCC-3'；

B、DNA模板制備：

在檢測(cè)煙草病根樣品時(shí)：將病根樣品表面的附著物去除，挑取根結(jié)線蟲卵塊或根結(jié)組織置于滅菌后的研缽中，加入液氮研磨成粉末轉(zhuǎn)入離心管中，加入DNA提取緩沖液，置于50~60℃水浴保溫50~70min，冷卻至室溫，用等體積的酚-氯仿-異戊醇混合溶劑和氯仿-異戊醇混合溶劑依次抽提，取上清液加等體積的異丙醇沉淀，沉淀經(jīng)體積百分濃度60~80%的乙醇溶液清洗并干燥后，溶于滅菌純凈水中，調(diào)節(jié)DNA濃度值50ng/μl，得到用于PCR檢測(cè)的DNA模板制備液；

在檢測(cè)樣品為煙草根際土壤時(shí)：取土壤樣品采用常規(guī)方法進(jìn)行土壤線蟲分離，將得到的線蟲懸浮液置于解剖鏡下觀察，挑取其中疑似根結(jié)線蟲二齡幼蟲或雄成蟲的線蟲2~3條至10μl的100ng/μ的蛋白酶K溶液中，用解剖針將線蟲切斷，60℃水浴1h后95℃加熱10min，冷卻至室溫即得用于PCR檢測(cè)的DNA模板制備液；

C、PCR擴(kuò)增：以用于PCR檢測(cè)的DNA模板制備液進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR反應(yīng)體系為1×PCR buffer，1U Taq酶，0.2mM dNTPs，以及引物TR1、TR2、TR3、TR4、TR5和TR6各0.4μM的25μl PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 2min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：94℃ 45s，52℃ 60s，72℃ 90s；最后再72℃延伸10min；

D、產(chǎn)物檢測(cè)：取5~10μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳電泳，結(jié)束后經(jīng)溴化乙錠染色后再紫外透射儀下觀察，如檢測(cè)到分子量為700bp的電泳譜帶表明受檢樣品中含有南方根結(jié)線蟲，如檢測(cè)到分子量為260bp的電泳譜帶表明受檢樣品含有花生根結(jié)線蟲，如檢測(cè)到分子量為570bp的電泳譜帶表明受檢樣品中含有爪哇根結(jié)線蟲。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草根結(jié)線蟲病中三種主要病原線蟲的同步檢測(cè)鑒定方法，其特征在于，B步驟中所述的DNA提取緩沖液為200mmol/L Tris-HCl pH＝8.5，250mmol/LNaCl， 25mmol/L EDTA，0.5%SDS組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草根結(jié)線蟲病中三種主要病原線蟲的同步檢測(cè)鑒定方法，其特征在于，B步驟中所述的酚-氯仿-異戊醇混合溶劑中酚、氯仿和異戊醇的體積配比為25:24:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草根結(jié)線蟲病中三種主要病原線蟲的同步檢測(cè)鑒定方法，其特征在于，B步驟中所述的氯仿-異戊醇混合溶劑中氯仿和異戊醇的體積配比為24:1。