[發明專利]一種煙草根結線蟲病中三種主要病原線蟲的同步檢測鑒定方法

有效

• 申請號: 201810129683.9
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108300791B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 李梅云;吳文濤;宋中邦;張靖;曾建敏;王揚;王丙武;焦芳嬋;高玉龍;吳興富;李永平;李文正
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116
• 代理人: 姜開俠;謝喬良

本發明公開了一種煙草根結線蟲病中三種主要病原線蟲的同步檢測鑒定方法。包括PCR引物設計、DNA模板制備、PCR擴增、產物檢測步驟。本發明根據南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲的種類特異區序列設計了包含6條PCR引物用于上述3種根結線蟲的種類鑒定，鑒定的穩定性好、準確性高；所設計的6條引物組合使用，可以實現1次PCR反應完成3種煙草根結線蟲病病原線蟲的同步檢測，鑒定方便、省時；采用普通PCR儀和常規試劑，檢測成本，利于推廣應用；本發明包含設計了針對病根樣品和土壤樣品的DNA制備方法，可以以包括卵、幼蟲和成蟲在內的各發育階段的根結線蟲為對象進行種類鑒定，具有廣泛的使用范圍。

技術領域

本發明屬于植物病害病原檢測技術領域，具體涉及一種煙草根結線蟲病中三種主要病原線蟲的同步檢測鑒定方法。

背景技術

根結線蟲（Meloidogyne spp．）是植物病原線蟲中種類最多、分布最廣和危害最嚴重的一類線蟲。這類線蟲主要以土壤傳播的形式，危害植物的根系，使受害植物的根部形成腫瘤狀的根結，從而發生嚴重影響植物正常生長發育的根結線蟲病，已知受根結線蟲病危害的植物主要包括茄科、豆科、葫蘆科、禾本科、傘形花科等3000多種，在溫帶、亞熱帶和熱帶地區的植物受害尤其嚴重。其中尤以煙草受根結線蟲危害最為嚴重，據聯合國糧農組織估計，發達國家因根結線蟲造成的煙草損失平均每年為4%，全世界的平均損失估計為10%，發展中國家的損失超過25%。在我國自20世紀80年代中后期以來，煙草根結線蟲病病區不斷擴大，危害加重，在河南、山東、云南、貴州、四川、湖北等煙區發生較為普遍，危害較重，病區發病率一般為70%~100%，重者達90%以上，減產30%~70%，成為了我國煙草生產上的主要病害。

根結線蟲屬于土壤習居性生物，由于受到土壤環境的限制外部施加的物理、化學因素很難對根結線蟲起作用，尤其是近年來，用于根結線蟲病防治的多數化學殺線蟲劑存在高毒、高殘留的弊端，已在世界范圍內被普遍禁用。因此采取安全高效的根結線蟲病防控方法已成為大勢所趨。在煙草根結線蟲病的防控過程中，選擇采用合適的抗病煙草品種被認為是一項經濟、高效、綠色的措施。然而，根結線蟲種類繁多，不同根結線蟲對寄主植物的致病能力不同，抗病品種對根結線蟲的抗性范圍也有限，當前國內煙草上分布最廣泛危害最嚴重的根結線蟲主要是花生根結線蟲（Meloidogyne arenaria）、南方根結線蟲（M. incognita）和爪哇根結線蟲（M. javanica），這三種根結線蟲的形態和分子生物學特征極為相似，但對不同煙草品種存在較大的致病性差異。因此準確、快速鑒定上述三種根結線蟲是選育和利用抗病煙草品種的前提條件。

鑒定根結線蟲種類最常用的方法是形態學方法，該方法通過顯微操作方法切割根結線蟲雌成蟲會陰區角質膜，在顯微鏡下觀察會陰區花紋的差異來確定根結線蟲的種類。這種方法的優點是簡便、直觀，存在的弊端是：1. 根結線蟲種類多，許多種類的會陰花紋特點比較容易混淆，使得鑒定的準確性完全依靠操作者的經驗，誤判的概率較高；2. 同一種類的根結線蟲的會陰花紋存在個體差異，在實際操作時至少需要對20頭以上的雌成蟲進行觀察才能確診，費工、費時；3. 形態學鑒定只適用于成蟲，不適宜幼蟲，而土壤中分離到的根結線蟲都是以二齡幼蟲的形式存在，使的該方法在實際應用中受到限制。另外，同工酶電泳方法也是根結線蟲鑒定中常用的方法，該方法以根結線蟲雌成蟲的蛋白粗提物進行聚丙烯酰胺電泳，通過酯酶和蘋果酸脫氫酶同工酶染色后根據酶帶的譜型來進行種類判斷，該方法部分克服了形態學鑒定的缺點，可以比較快速準確的判斷根結線蟲種類，但依然只能用雌成蟲來作為鑒定對象。