[發明專利]一種電轉后PBMC的培養方法

在審

• 申請號: 201810129577.0
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN110129268A
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發明（設計）人: 金華君;徐飛;劉韜;李林芳;錢其軍
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療集團有限公司;上海細胞治療研究院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發明提供一種電轉后PBMC的培養方法，該方法包括電轉人外周血單個核細胞后，先使用含人外周血單個核細胞培養液的上清液的復蘇液培養該電轉后的人外周血單個核細胞2?10小時的步驟。本發明還包括使用所述復蘇液復蘇凍存的人外周血單個核細胞以及培養人外周血單個核細胞的方法。本發明也包括所述復蘇液。本發明的復蘇液能促進電轉后外周血單個核細胞的生長，進而提高其活力；采用本發明的復蘇液對冷凍人外周血單個核細胞進行復蘇和電轉后孵育，能夠有效減少冷凍復蘇細胞在電轉后的死亡，促進細胞增殖。

技術領域

本發明涉及電轉后PBMC的培養方法。

背景技術

細胞免疫治療已經成為一種極具潛力和療效顯著的全新抗腫瘤療法，彌補 了傳統的手術、放療和化療的弊端。在癌癥免疫療法中，過繼行細胞免疫療法 近年來取得了長足的進步，其中以嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor， CAR)修飾的T細胞為代表的腫瘤靶向免疫治療的成就最為突出，在體外和臨 床試驗中表明出良好的靶向性、殺傷腫瘤性和持續性，展現出巨大的應用潛力 和市場。

嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)是將能識別某種腫瘤抗原的抗體的 抗原結合部與CD3-ζ鏈或FcεRIγ的胞內部分在體外偶聯為一個嵌合蛋白， 通過基因轉導的方法轉染患者的T細胞，使其表達嵌合抗原受體(CAR)。患者 的T細胞被“重編碼”后，生成大量腫瘤特異性的CAR-T細胞。這是一個出 現了很多年，但是近幾年才被改良使用到臨床上的新型細胞療法。和其它免疫 療法類似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫細胞來清除癌細胞，但是不 同的是，這是一種細胞療法，而不是一種藥。

在2017年8月30日，醫藥行業迎來一條重磅新聞，諾華的基因治療方法 CAR-T細胞藥物Kymriah(tisagenlecleucel，CTL-019)被美國FDA批準上市， 用于治療兒童和年輕成人(2～25歲)的急性淋巴細胞白血病(ALL)。這是醫 學史上首款批準的CAR-T療法，也是在美國境內，首次獲批的基因療法。

現今，多數研究人員使用AIM-V培養基培養CAR-T細胞，在電轉完T細 胞后加入CTS^TM無血清細胞培養基培養。但是采用AIM-V培養基去培 養電轉后的T細胞存在諸多缺點：

1、轉染后的T細胞死亡較多；

2、轉染后的T細胞增殖緩慢。

因此，急需一種能夠有效促進電轉后的T細胞增殖并能夠高效表達CAR 基因的培養基和培液方法。

發明內容

鑒于此，本發明提供了一種培養方法。該培養基方法在培養電轉后人外周 血單個核細胞(PBMC)尤其是T細胞時，能夠提高細胞活率和細胞增殖倍數。

具體而言，本發明提供一種培養電轉后的人外周血單個核細胞的方法，所 述方法包括電轉人外周血單個核細胞后，先使用含人外周血單個核細胞培養液 的上清液的復蘇液培養該電轉后的人外周血單個核細胞2-10小時的步驟。

還提供的是一種人外周血單個核細胞的培養方法，所述方法包括使用含人 外周血單個核細胞培養液的上清液的復蘇液培養該人外周血單個核細胞的步 驟。

還提供的是一種復蘇凍存的人外周血單個核細胞方法，所述方法包括使用 含有人外周血單個核細胞培養液的上清液的復蘇液懸浮和培養解凍后的人外 周血單個核細胞的步驟。

還提供的是一種制備電轉的人外周血單個核細胞的方法，所述方法包括所 述復蘇、電轉前的培養以及電轉后的培養的步驟；其中，所述復蘇包括使用含 有人外周血單個核細胞培養液的上清液的復蘇液懸浮和培養解凍后的人外周 血單個核細胞；所述電轉前的培養包括，復蘇后，使用含人外周血單個核細胞 培養液的上清液的復蘇液培養該人外周血單個核細胞；所述電轉后的培養包括， 電轉后，先使用含人外周血單個核細胞培養液的上清液的復蘇液培養該電轉后 的人外周血單個核細胞2-10小時。