[發明專利]缺失OPRT和LDH1基因的弓形蟲減毒活疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201810127384.1
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108379570B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 申邦;周太芳;夏寧波;趙俊龍;周艷琴;方瑞;賀蘭;潘明;崔建敏;楊旭柯
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: A61K39/002
• 分類號: A61K39/002;A61P33/02;C12N1/11;C12N15/113;C12N15/90
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種預防弓形蟲感染的減毒活疫苗，該疫苗含有同時缺失了乳清酸磷酸核糖轉移酶(OPRT)基因和乳酸脫氫酶1(LDH1)基因的弓形蟲疫苗蟲株，其中，乳清酸磷酸核糖轉移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，乳酸脫氫酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本發明用于預防動物弓形蟲病的減毒弓形蟲活疫苗，其疫苗蟲株由于敲除了OPRT和LDH1兩個基因，具有毒力弱、幾乎沒有致病性的優點，能夠用于預防動物的弓形蟲感染，有成為制備抗弓形蟲基因工程疫苗的潛力。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及預防弓形蟲感染的減毒活疫苗，尤其是缺失乳清酸磷酸核糖轉移酶(OPRT)和乳酸脫氫酶1(LDH1)基因的弓形蟲減毒活疫苗，本發明還涉及該疫苗的制備方法。

背景技術

弓形蟲可以感染包括人在內的幾乎所有的溫血動物，引起人畜共患弓形蟲病。人和動物主要由于誤食被弓形蟲和其卵囊污染的肉類而感染，全球大概有1/3的人存在弓形蟲感染。當人體免疫力正常，感染弓形蟲時一般不會表現明顯的臨床癥狀，而在免疫缺陷的個體中，感染弓形蟲則會導致發燒、失明、腦炎等，嚴重威脅人類的生命健康。在畜牧業生產中，弓形蟲感染導致豬、羊等動物的流產、死胎、畸形胎兒，造成重大的經濟損失。然而，針對弓形蟲病的預防至今沒有良好的疫苗，DNA等亞單位疫苗僅能產生極低的部分免疫保護效果且處于科研階段，目前市場上唯一的商品化弓形蟲疫苗是從羊流產死胎中分離得到的弓形蟲S48株，通過在實驗室傳統傳代致弱后制備，該疫苗存在著毒力返強的風險，且并不適用于我國的畜牧業養殖中。

尿苷酸(UMP)是所有其他嘧啶核苷酸的前體，是組成RNA的重要核苷酸之一。弓形蟲體內的尿苷酸的合成有兩個途徑，從頭途徑和補救途徑。其中從頭途徑是合成尿苷酸的最主要途徑，補救途徑合成的量不能滿足弓形蟲的需要。乳清酸磷酸核糖轉移酶(OPRT)是弓形蟲尿苷酸從頭合成途徑中的一個關鍵酶，它可催化乳清酸與磷酸核糖焦磷酸(PRPP)作用獲得磷酸核糖形成乳清酸核苷酸。弓形蟲體內尿苷酸含量不足則會引起嚴重的遺傳損傷，使弓形蟲喪失復制的能力，進而影響其對宿主的毒力。此外，本研究小組前期開發出了一種缺失乳酸脫氫酶1(LDH1)的弓形蟲突變體，發現該突變體能在體外正常生長，但感染動物后不能在體內復制，顯著降低致病性。基于弓形蟲病防治存在的問題和本課題組的前期研究基礎，我們采用基因編輯技術，構建具有良好免疫原性和免疫保護力的減毒弓形蟲疫苗蟲株，對于人類健康和畜牧養殖業的發展均有重要價值和意義。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的缺陷和不足，提供一種預防弓形蟲感染的減毒活疫苗及其制備方法。

為實現上述發明目的，本發明提供一種預防弓形蟲感染的減毒活疫苗，該疫苗含有同時缺失了乳清酸磷酸核糖轉移酶基因和乳酸脫氫酶1基因的弓形蟲疫苗蟲株，其中，乳清酸磷酸核糖轉移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，乳酸脫氫酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

該疫苗的制備方法包括以下步驟：

1.弓形蟲疫苗蟲株的構建：

1)出發蟲株為具有乳清酸磷酸核糖轉移酶基因和乳酸脫氫酶1基因的球蟲目弓形蟲科弓形科屬的II型蟲株，所述乳清酸磷酸核糖轉移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述乳酸脫氫酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgoprt質粒的構建:以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3質粒為模板，利用上下游引物擴增，將MIC3靶點特異的gRNA替換為乳清酸磷酸核糖轉移酶基因靶點特異的gRNA，轉換DH5α得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgoprt質粒，其中，上游引物gRNA-oprt-Fw:

5’–GTCCAGGAGTAAGACCCGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’，

下游引物gRNA-R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；