[發(fā)明專利]一種用緊穗野生稻成熟種子繁育再生植株的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810125522.2
• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108293876A
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發(fā)明（設計）人: 王玲仙;付堅;陳越;程在全;鐘巧芳;殷富有;陳玲;張敦宇;柯學;肖素勤;王波;曾民;蔣聰;雷涌濤;趙才美
• 申請（專利權）人: 云南省農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

本發(fā)明涉及一種用緊穗野生稻成熟種子繁育再生植株的方法，屬植物組織培養(yǎng)技術領域。本發(fā)明方法包括：外植體的去除種皮處理，外植體滅菌，種子萌芽、愈傷組織誘導和增殖培養(yǎng)，愈傷組織分化培養(yǎng)，分化苗的生根培養(yǎng)、煉苗、移栽步驟。本發(fā)明運用不同植物激素組合和培養(yǎng)條件的組合，成功利用成熟種子誘導出緊穗野生稻愈傷組織，再將愈傷組織轉移到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，提高愈傷質量和數(shù)量。本發(fā)明的優(yōu)點在于：大幅度提高了緊穗野生稻成熟種子的愈傷誘導率和再生植株，繁殖效率高、節(jié)約成本，克服了緊穗野生稻難以用種子繁殖的難題，促進了緊穗野生稻的保存、保護和利用。

技術領域

本發(fā)明涉及一種用緊穗野生稻成熟種子繁育再生植株的方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術領域。

背景技術

野生稻資源是水稻育種中獲得有利外源基因的一個重要來源。緊穗野生稻(Oryzaeichingeri)具有CC染色體組，與栽培到親緣關系較遠，并具有許多優(yōu)良特性，如抗蟲、抗病、抗旱、植株高大、功能葉片耐衰老、良好生長優(yōu)勢等。目前，緊穗野生稻的繁殖手段主要是莖干扦插和分根移栽，但繁殖率低、繁殖時間長；緊穗野生稻結實率不高，種子落粒性強，即使收獲的種子品質較差并嚴重畸形，種子萌發(fā)率非常低，緊穗野生稻基本不能用種子進行繁殖，嚴重妨礙了緊穗野生稻的保存、保護和利用。

研究發(fā)現(xiàn)緊穗野生稻種子種皮堅硬，并有一層釉質包裹，種子極難吸收膨脹，造成種子萌發(fā)率極低，利用常規(guī)的浸泡和高溫催芽處理也很難提高緊穗野生稻種子的發(fā)芽率，利用種子誘導愈傷效率和成苗率也極低。本發(fā)明利用砂紙將緊穗野生稻種子的堅硬種皮磨破，使種子能充分吸水，提高種子萌發(fā)率來提高愈傷組織誘導率，運用不同植物激素組合和培養(yǎng)條件變化，成功的利用緊穗野生稻成熟種子誘導出愈傷組織并得到分化苗。

本發(fā)明提供的一種用緊穗野生稻成熟種子繁育再生植株的方法，經文獻檢索，未見與本發(fā)明相同內容的公開報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于突破了緊穗野生稻通過成熟種子獲得再生植株的困題，提供一種用緊穗野生稻成熟種子繁育再生植株的方法。

本發(fā)明的用緊穗野生稻成熟種子繁育再生植株的方法，其方法的具體步驟如下：

a.外植體選擇：收獲的緊穗野生稻成熟種子，用紙袋裝好，曬干，儲存于干燥通風的地方；

b.外植體處理：將曬干的成熟種子剝去谷殼，用購買的400目牛皮紙水砂紙將種皮磨掉，除干凈種皮的種子用蒸餾水洗2遍，裝在100mL的三角瓶中，用體積百分比為75％的酒精表面滅菌1分鐘，無菌水洗3遍，再加入50mL體積百分比為0.1％的氯化汞和10ul體積百分比為20％的吐溫滅菌處理20分鐘，期間每5分鐘搖動一次，倒掉氯化汞，再用體積百分比為75％的酒精表面滅菌1分鐘，用無菌水洗3遍，將種子取出用無菌吸水紙吸干種子表面的水分；

c.種子催芽：將b步驟處理后的種子放到鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入20mL無菌水，用封口膜將培養(yǎng)皿封口，置于人工氣候箱中28℃暗培養(yǎng)9天，期間每2天換一次水，待萌動芽長至0.2-0.5cm時，用于愈傷組織誘導；

d.愈傷組織誘導：將帶芽的種子取出放入誘導培養(yǎng)基，置于人工氣候箱28℃暗培養(yǎng)35天，芽的基部長出透明的帶有粘液的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)10-16天，待愈傷長至直徑0.2cm時進行愈傷繼代培養(yǎng)；愈傷誘導培養(yǎng)基為：N₆基本培養(yǎng)基+2,4-D 5.0mg/L+植物凝膠2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；

e.愈傷組織繼代：將帶有粘液的愈傷組織從種子上分離下來，接入愈傷繼代培養(yǎng)基中，置于人工氣候箱中28℃暗培養(yǎng)，每20天繼代一次，繼代2-3次后愈傷組織由白色變成淡黃色緊實顆粒；愈傷繼代培養(yǎng)基為：N₆基本培養(yǎng)基+2,4-D 3.0-4.0mg/L+植物凝膠2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；