[發明專利]一種用緊穗野生稻成熟種子繁育再生植株的方法

在審

• 申請號: 201810125522.2
• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108293876A
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 王玲仙;付堅;陳越;程在全;鐘巧芳;殷富有;陳玲;張敦宇;柯學;肖素勤;王波;曾民;蔣聰;雷涌濤;趙才美
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

1.一種用緊穗野生稻成熟種子繁育再生植株的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下：

a.外植體選擇：收獲的緊穗野生稻成熟種子，用紙袋裝好，曬干，儲存于干燥通風的地方；

b.外植體處理：將曬干的成熟種子剝去谷殼，用購買的400目牛皮紙水砂紙將種皮磨掉，除干凈種皮的種子用蒸餾水洗2遍，裝在100mL的三角瓶中，用體積百分比為75％的酒精表面滅菌1分鐘，無菌水洗3遍，再加入50mL體積百分比為0.1％的氯化汞和10ul體積百分比為20％的吐溫滅菌處理20分鐘，期間每5分鐘搖動一次，倒掉氯化汞，再用體積百分比為75％的酒精表面滅菌1分鐘，用無菌水洗3遍，將種子取出用無菌吸水紙吸干種子表面的水分；

c.種子催芽：將b步驟處理后的種子放到鋪有一層濾紙的培養皿中，加入20mL無菌水，用封口膜將培養皿封口，置于人工氣候箱中28℃暗培養9天，期間每2天換一次水，待萌動芽長至0.2-0.5cm時，用于愈傷組織誘導；

d.愈傷組織誘導：將帶芽的種子取出放入誘導培養基，置于人工氣候箱28℃暗培養35天，芽的基部長出透明的帶有粘液的愈傷組織，繼續培養10-16天，待愈傷長至直徑0.2cm時進行愈傷繼代培養；愈傷誘導培養基為：N₆基本培養基+2,4-D 5.0mg/L+植物凝膠2.8g/L+蔗糖30％,PH6.0；

e.愈傷組織繼代：將帶有粘液的愈傷組織從種子上分離下來，接入愈傷繼代培養基中，置于人工氣候箱中28℃暗培養，每20天繼代一次，繼代2-3次后愈傷組織由白色變成淡黃色緊實顆粒；愈傷繼代培養基為：N₆基本培養基+2,4-D 3.0-4.0mg/L+植物凝膠2.8g/L+蔗糖30％,PH6.0；

f.愈傷組織增殖：挑選直徑為0.2-0.5cm的淡黃色緊實顆粒狀愈傷組織，接入裝有繼代培養基的100ml三角瓶中，每瓶20個愈傷，置于溫度為28℃、光照為2000lx的培養箱中進行弱光培養，每7天更換一次培養基，繼代培養基同e步驟所述，21-28天后，愈傷組織大量增值覆蓋整個培養基表面，并呈現黃綠色；

g.愈傷組織分化：將黃綠色緊實顆粒狀的愈傷組織接入裝有分化培養基Ⅰ的100ml三角瓶中，每瓶10-15個，置于溫度為28℃,光照為4000lx的培養箱中，10-12天后，愈傷組織變為深綠色后，將深綠色的愈傷組織轉入分化培養基Ⅱ中于溫度為28℃,光照為4000lx的培養箱中繼續培養20-25天，愈傷分化出小苗，待小苗長至2-3cm長時，轉入壯苗培養基進行壯苗；分化培養基Ⅰ為：N₆基本培養基+6-BA 6mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 2mg/L+ZT 2mg/L+植物凝膠2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；分化培養基Ⅱ為：N₆基本培養基+6-BA 4mg/L+NAA 0.3mg/L+KT2mg/L+ZT 2mg/L+植物凝膠2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；

h.壯苗培養：將2-3cm長的小苗從培養瓶中取出接入壯苗培養基中，置于28℃，4000lx的光照培養箱中培養20-27天，小苗莖干增粗并長至4-5cm高時，進行生根培養；壯苗培養基為：N₆基本培養基+6-BA 2mg/L+IAA 0.3mg/L+TDZ 2mg/L+植物凝膠2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；

I.生根培養：將4-5cm高的健壯無根苗接入裝有生根培養基的直徑5cm、長20cm的試管中，沒根試管2-3株，置于28℃，2000lx的光照培養箱中進行生根培養，每10天更換一次培養基，20-25天后，根長至5-7cm，苗長至10-12cm后進行煉苗；生根培養基為：N₆基本培養基+IAA 0.3mg/L+植物凝膠2.8g/L+蔗糖30％，PH6.0；

J.煉苗：將苗從試管中取出，用28℃自來水將苗根部的培養基沖洗干凈，放入直徑5cm、長20cm的試管中，加水淹沒根部，管口敞開，置于28℃，2000lx的光照培養箱中，5天后，將苗從光照培養箱中移出，栽到購于市場的營養基質中，置于溫室進行常規培養，直至葉片展開、新根長出，移入較大的花盆中，常規培養直至種子成熟。