[發明專利]檢測多種炎癥生物標志物的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201810123907.5
• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108459162A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 葉雷
• 申請（專利權）人: 深圳賽斯鵬芯生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 深圳中一聯合知識產權代理有限公司 44414
• 代理人: 張全文

本發明提供了一種聯合檢測多種炎癥生物標志物的試劑盒，包括融血試劑、微球試劑和熒光試劑，所述融血試劑中含有表面活性劑；所述微球試劑包括直徑不同的N種微球，所述N種微球上分別對應偶聯N種炎癥生物標志物的第一單克隆抗體，且所述第一單克隆抗體上標記有生物素，其中，N的取值范圍為2～10的正整數；所述熒光試劑包括所述N種炎癥生物標志物的第二單克隆抗體，所述第二單克隆抗體上標記有熒光素，且所述第一單克隆抗體、所述第二單克隆抗體與抗原的結合位點不同。

技術領域

本發明屬于分子生物技術技術，尤其涉及一種聯合檢測多種炎癥生物標志物的方法及其試劑盒。

背景技術

免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體(或抗原)檢測組織、細胞或血清中的相應抗原(或抗體)的方法。由于熒光抗體具有安全、靈敏的特點，因此廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。目前常用的免疫熒光技術包括：放射免疫，酶聯免疫，乳膠比濁，干式熒光免疫，時間分辨熒光免疫，化學發光免疫等等。化學發光免疫是目前最主流的免疫檢測方法，檢測原理通常為：將磁性微球作為固相材料偶聯單克隆抗體(一抗)，與抗原反應后，加入酶標記的單克隆抗體(二抗)，充分反應后經洗滌、分離和純化去除未反應的試劑。然后加入發光底物(發光顯色劑)，在適當的孵育條件下，底物被酶催化顯色。最后根據反應液整體發光強度判斷抗原濃度，對單個項目進行定量測定。該方法檢測速度快、靈敏度高，廣泛應用在檢驗科中心實驗室。但一方面，由于檢測階段須測定反應液的整體發光值，因此在抗原抗體反應階段，需要加入過量的二抗試劑，來獲得充分反應，進而在孵育之后要進行多步驟的洗滌和磁分離，來去除過量未反應的二抗試劑。這使得整個儀器結構復雜，成本變高，體機變大，檢測速度變慢。另一方面，化學發光免疫僅能夠使用血清作為測定樣本，臨床收集全血后還要進行血液分層和血清抽提，增加了臨床使用的復雜程度和污染風險，無法在門急診和基層醫療機構廣泛開展。此外，采用化學發光免疫技術每次檢測只能測定一個項目，無法實現多個項目的同時檢測。

干式熒光免疫由于其操作方便，廣泛應用。干式熒光免疫技術的方法通常為：全血或血清樣本經過濾網后進入樣品墊，樣本中如有待測抗原，待測抗原首先在結合墊下與熒光素標記的單克隆抗體(一抗)結合，形成抗原-抗體*熒光素復合物，并靠毛細作用向測試線移動。測試線上固定有另一單克隆抗體(二抗)，當反應液層析至測試線時，可以進一步形成標記有熒光素的雙抗夾心復合物，用相應波長的激光照射檢測線上聚積的反應物產生熒光，從而進行定量測定。但采用干式熒光免疫檢測時，由于固相液相反應本身存在更大的不確定性，而且反應物在測試線位置的堆積是有厚度的，而激光僅能把測試線表面的熒光素激發，因此干式熒光試條的批內精密度CV通常超過10％(CV＝同一個樣本20次測定的標準差/平均值*100％)，即精密度不足，這限制了干式熒光免疫技術的應用。此外，干式試條每個測試都要有固相載體、NC膜、干式反應需要大量的抗體，因此試劑成本遠高于液相的試劑(如化學發光免疫、懸浮陣列免疫等)。

發明內容

本發明的目的在于提供一種聯合檢測多種炎癥生物標志物的方法及其試劑盒，旨在解決現有的炎癥標志物的免疫檢測方法，只能針對血清樣本進行檢測，而且檢測時間長、操作復雜、價格高，且每個測試只能測定一個項目的問題。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明一方面提供一種聯合檢測多種炎癥生物標志物的試劑盒，包括融血試劑、微球試劑和熒光試劑，

所述融血試劑中含有表面活性劑；

所述微球試劑包括直徑不同的N種微球，所述N種微球上分別對應偶聯N種炎癥生物標志物的第一單克隆抗體，且所述第一單克隆抗體上標記有生物素，其中，N的取值范圍為2～10的正整數；

所述熒光試劑包括所述N種炎癥生物標志物的第二單克隆抗體，所述第二單克隆抗體上標記有熒光素，且所述第一單克隆抗體、所述第二單克隆抗體與抗原的結合位點不同。

以及，一種聯合檢測多種炎癥生物標志物的方法，至少包括以下步驟：