[發(fā)明專利]檢測人類VDR、GC、LRP5、SLC30A8基因多態(tài)性的引物對、探針及試劑盒

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• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108384844A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳宇亮;李科錚;李嬋;鐘宇萍;陳婷;遲海濱;楊勇
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳鼎新融合科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6883
• 代理公司: 深圳市徽正知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44405
• 代理人: 李想

1.一種檢測人類VDR、GC、LRP5、SLC30A8基因多態(tài)性的引物對，用于多重不對稱PCR特異性擴(kuò)增VDR、GC、LRP5、SLC30A8基因片段，其特征在于，用于特異性擴(kuò)增人VDR基因片段SNP位點rs1544410的上游引物F1如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，下游引物R1如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

用于特異性擴(kuò)增人GC基因片段SNP位點rs2282679的上游引物F2如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，下游引物R2如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

用于特異性擴(kuò)增人LRP5基因SNP位點rs3736228片段的上游引物F3如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，下游引物R3如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

用于特異性擴(kuò)增人SLC30A8基因片段SNP位點rs13266634的上游引物F4如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，下游引物R4如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

2.一種檢測人類VDR、GC、LRP5、SLC30A8基因多態(tài)性探針，尤其適用于多重不對稱熒光PCR探針熔解曲線法檢測人類VDR、GC、LRP5、SLC30A8基因多態(tài)性，其特征在于，該探針為改良分子信標(biāo)熒光探針，所述探針包括：

用于檢測人VDR基因SNP位點rs1544410的改良分子信標(biāo)熒光探針P1為如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；

用于檢測人GC基因SNP位點rs2282679的改良分子信標(biāo)熒光探針P2為如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；

用于檢測人LRP5基因SNP位點rs3736228的改良分子信標(biāo)熒光探針P3為如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；

用于檢測人SLC30A8基因SNP位點rs13266634的改良分子信標(biāo)熒光探針P4為如SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列。

3.一種檢測人類VDR、GC、LRP5、SLC30A8基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的引物對R1和F1、R2和F2、R3和F3、R4和F4，以及如權(quán)利要求2所述的改良分子信標(biāo)熒光探針P1、P2、P3、P4。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測人類VDR、GC、LRP5、SLC30A8基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括以下檢測體系：

Taq HS 5U；

dNTP MIX 200uM；

上游引物F1、F2、F3、F4各0.1uM，下游引物R1、R2、R3、R4各1uM；

分子信標(biāo)熒光探針P1、P2、P3、P4各0.2uM；

1*PCR Buffer；

其中，所述1*PCR Buffer中含有10mM的pH 8.3的Tris-HCl，50mM的KCl，1.5mM的MgCl₂；上述檢測體系的總體積為25ul的反應(yīng)體系。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測人類VDR、GC、LRP5、SLC30A8基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，利用試劑盒進(jìn)行多重不對稱熒光PCR探針熔解曲線檢測程序如下：

1)95℃10min；

2)95℃15s→65℃-55℃20s(-1℃/cycle)→72℃15s，10個循環(huán)；

3)95℃15s→60℃20s→72℃20s，50個循環(huán)；

4)72℃3min；

5)95℃30S→30℃30S→30℃～79.5℃→12℃2min，其中，30℃～79.5℃以0.1℃/s的升溫速率，每升溫0.3℃采集一次熒光進(jìn)行熔解曲線分析，且在此階段采集VDR、GC、LRP5、SLC30A8熒光信號。