[發(fā)明專利]細(xì)鱗壯鱈的熒光PCR檢測(cè)方法及其引物和探針

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810122147.6
• 申請(qǐng)日: 2018-02-07
• 公開（公告）號(hào): CN110117664A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳姍;董強(qiáng);虞惠貞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建譯寧科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京京萬通知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11440
• 代理人: 萬學(xué)堂

1.一種細(xì)鱗壯鱈的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針由下表中的序列組成：

其中，AP-F表示上游引物；AP-R表示下游引物；AP-P表示探針。

2.一種細(xì)鱗壯鱈的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，至少包括如下步驟：

S1：設(shè)計(jì)細(xì)鱗壯鱈的引物和探針，所述引物和探針至少由下表中的一種組成：

其中，AP-F表示上游引物；AP-R表示下游引物；AP-P表示探針；

S2：提取細(xì)鱗壯鱈樣品中的DNA；

S3：根據(jù)所述引物和探針及DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得檢測(cè)結(jié)果；

S4：將檢測(cè)結(jié)果與預(yù)設(shè)的Ct值比較，判定樣品特性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述細(xì)鱗壯鱈的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述上游引物的濃度為10pmol/μL，下游引物的濃度為10pmol/μL，探針的濃度為10pmol/μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述細(xì)鱗壯鱈的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S2具體為：

S21：獲取0.2g細(xì)鱗壯鱈樣品，并在液氮中研磨；

S22：使用DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA抽提；

S23：將抽提后的DNA溶解在100μL水中，獲得DNA液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述細(xì)鱗壯鱈的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S3具體為：

S31：獲取10μL的Premix Ex Taq，0.4μL的上游引物，0.4μL的下游引物，0.4μL的探針以及1μL的DNA液，并加水補(bǔ)足至20μL；

S32：使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序如下：

95℃預(yù)變性10sec；95℃變性5sec；60℃退火并延伸23sec，執(zhí)行40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的60℃退火并延伸階段收集熒光信號(hào)，以獲得檢測(cè)結(jié)果。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述細(xì)鱗壯鱈的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟S3后，還包括步驟S30：設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及提取空白對(duì)照。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述細(xì)鱗壯鱈的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟S4之前，還包括步驟S40：獲取真核生物的引物和探針，并作為內(nèi)參照引物和探針；其中真核生物的引物和探針由下表中的序列組成：

其中18SrRNA-F表示上游引物，18SrRNA-R表示下游引物，18SrRNA-P表示探針。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述細(xì)鱗壯鱈的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S4具體為：

S41：若檢測(cè)結(jié)果顯示空白對(duì)照、陰性對(duì)照無FAM熒光信號(hào)，陽性對(duì)照Ct值小于等于30，則判定實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)有效，否則反應(yīng)無效；

S42：在實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)有效的前提下，用內(nèi)參照引物探針篩選出Ct值≤30的樣品；

S43：在Ct值≤30的樣品中的特異性曲線出現(xiàn)擴(kuò)增曲線時(shí)，則表示DNA抽提有效，否則應(yīng)重新提取DNA，直至Ct值≤30；

S44：在實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)有效，且抽提的DNA有效的情況下，細(xì)鱗壯鱈的特異性引物探針檢測(cè)得到的Ct值≤35時(shí)，則判斷樣品為陽性，若Ct值＞35，則判斷樣品為陰性。