[發明專利]微量細胞ChIP法

有效

• 申請號: 201810121175.6
• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108315387B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 何愛彬;李晨;艾珊珊
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳嘯寰

本發明涉及一種微量細胞ChIP法。所述方法包括：1).將待檢測細胞樣品分為n組，n為非0自然數；2).將第n組樣品交聯固定；3).使用細胞膜打孔劑處理所述第n組樣品；4).使用Tn5轉座酶酶切打斷第n組樣品的染色質片段，并將barcode序列和引物序列連接在產物片段DNA的兩端；當n≥2時，步驟4)中每組所用的barcode序列和/或引物序列不同；5).當n≥2時，將各組樣品合并；6).富集與靶蛋白結合的DNA片段，并用以所述引物作為index建庫，測序分析。該方法測序時建庫效率高，且能實現對極微量細胞的轉錄因子位點捕捉，并保證較好效率，穩定性和精確度都較好。

技術領域

本發明涉及分子生物學實驗技術領域，具體而言，涉及一種微量細胞ChIP法。

背景技術

生物的基因調控和表達是極其復雜但有序的過程，生物體基因組DNA在細胞中以染色質形式存在，蛋白質和DNA互作是細胞行使功能的重要基礎。因此，研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用可以進一步了解基因表達及其調控模式。

染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是研究DNA-蛋白質在體內相互作用的標準方法。染色質免疫共沉淀技術可以定位分析體內蛋白質與DNA的作用位點，運用ChIP技術與其他方法相結合，例如與高密度芯片(microarray)、測序(sequencing)、體內足跡法等技術相結合可以獲得整個基因組水平的單一轉錄因子分布圖譜、反式因子體內結合位點，以及系統揭示核小體定位、組蛋白修飾等表觀遺傳的遺傳機制。

ChIP技術的一般技術流程為：首先對細胞或組織進行不同時間的甲醛交聯，分別裂解細胞膜及細胞核，使用超聲方式將染色質打碎成一定長度范圍的片段。加入抗體，抗體會特異性地與靶蛋白結合，而后通過磁珠與抗體的相互作用，將靶蛋白及與其結合的DNA片段富集。解交聯并消化蛋白后，對捕獲的DNA片段建庫，進行第二代測序。根據數據片段在基因組上的富集情況，進而獲得全基因組水平的特定蛋白與DNA相互作用的圖譜。

然而，現有的ChIP-seq技術主要存在如下問題：

1.建庫效率低，不適用于少量細胞實驗

利用適當的超聲條件獲得片段大小合適的DNA-染色質復合物是整個染色質免疫共沉淀實驗成功的前提，然而使用超聲法打斷的ChIP-seq技術對細胞數量有一定的要求，適用于幾萬至百萬數量級的細胞處理。主要原因是傳統Illumina的TruSeq建庫策略中的adaptor與DNA片段連接效率較低，而使得很多片段在后面的擴增集中沒有被富集而丟失。尤其當研究的問題需要針對少量細胞群體的時候，嚴重的信息丟失使得實驗者無法獲得較為準確的真實信息。

2.超聲法打斷染色質片段方法不利于與DNA間接結合的轉錄因子的研究

全基因組范圍內，有很多轉錄因子不是與基因組DNA直接結合的，而是與其他轉錄因子結合后，間接地結合在基因組DNA上。即使是甲醛交聯過的樣品，這種間接結合也比較容易被破壞。超聲過程具有一定程度的物理破碎強度，容易干擾這些間接結合靶蛋白與DNA結合的穩定性，而造成后續信息的丟失。

3.文庫非特異性背景較高，檢測分辨率低

超聲打斷法是對染色質進行隨機打斷，獲得一定長度范圍內的片段。因此，在靶蛋白及DNA復合物的周圍也帶有一些非靶蛋白特異結合的DNA序列或是其他蛋白結合的位點。這些非特異性位點在后面建庫測序過程中均會被保存下來，成為靶蛋白圖譜分析的干擾背景，獲得寬峰，降低了檢測結合位點的分辨率和準確性。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明涉及一種微量細胞ChIP法，包括：

1).將待檢測細胞樣品分為n組，n為非0自然數；

2).將第n組樣品交聯固定；