[發明專利]微量細胞ChIP法

有效

• 申請號: 201810121175.6
• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108315387B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 何愛彬;李晨;艾珊珊
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳嘯寰

1.一種微量細胞ChIP法，其特征在于，包括：

1）. 將待檢測細胞樣品分為n組，n為非0自然數；

2）. 將第n組樣品交聯固定；

3）. 使用細胞膜打孔劑處理所述第n組樣品；

4）. 使用Tn5轉座酶酶切打斷第n組樣品的染色質片段，并將barcode序列和引物序列連接在產物片段DNA的兩端；

當n≥2時，步驟4）中每組所用的barcode序列和/或引物序列不同；

5）. 當n≥2時，將各組樣品合并；

6）. 富集與靶蛋白結合的DNA片段，并用以所述引物作為index建庫，測序分析；

在步驟1）之后、步驟2）之前還包括：使用含有SDS的溶液松散甲醛交聯過的細胞樣品中的染色質；所述含有SDS的溶液中SDS的濃度為0.1 w/v%~1.0 w/v%；所述使用含有SDS的溶液松散甲醛交聯過的細胞樣品中的染色質的步驟具體包括：將所述細胞樣品使用含有SDS的溶液于37℃下處理3min；交聯為用1 v/v %濃度的甲醛交聯細胞3min；

在步驟2）之后、步驟3）之前還包括：超聲處理以打開染色質緊密結構；所述超聲處理的條件為：140 Hz~180 Hz，超聲10s~20s；

在步驟4）中，在所述Tn5轉座酶酶切的反應體系中包括來自第i組樣品染色質、連接有所述barcode序列和所述引物序列的Tn5轉座酶；所述Tn5轉座酶在所述反應體系中的終濃度為：0.01~0.05 μl/20μl；所述Tn5轉座酶酶切的反應條件為：37℃孵育5min~60min。

2.根據權利要求1所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，所述第n組樣品的細胞數目≥1。

3.根據權利要求2所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，1≤所述第n組樣品的細胞數目≤1000000。

4.根據權利要求3所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，1≤所述第n組樣品的細胞數目≤1000。

5.根據權利要求1所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，在步驟2）中，所述細胞膜打孔劑具體為含有Triton X-100的溶液。

6.根據權利要求5所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，所述含有Triton X-100的溶液中Triton X-100的濃度為0.5 v/v %~2 v/v %。

7.根據權利要求6所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，所述使用細胞膜打孔劑處理細胞的處理條件為：10℃~37℃孵育5min~60min。

8.根據權利要求1所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，在步驟5）之后、步驟6）之前還包括：

對步驟4）或5）所得到的樣品離心棄上清，用含有0.01 w/v%~0.05 w/v% SDS的稀釋緩沖液重懸沉淀，于0℃~6℃孵育裂解20min~60min；超聲處理將目的DNA片段從細胞核中釋放出來。

9.根據權利要求8所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，在SDS的稀釋緩沖液重懸沉淀之后、超聲處理將目的DNA片段從細胞核中釋放出來之前還包括：超聲打散沉淀；所述超聲打散沉淀的超聲條件為：140 Hz~180 Hz，3s~7s。

10.根據權利要求8所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，所述超聲處理將目的DNA片段從細胞核中釋放出來的超聲條件為：140 Hz~180 Hz，每個循環內：10s~20 s ON，20 s~40sOFF。

11.根據權利要求1所述的微量細胞ChIP法，其特征在于，在步驟6）中，所述富集與靶蛋白結合的DNA片段的方法包括：

加入靶標蛋白對應的抗體孵育后，用偶聯Protein A的珠子拉取所述抗體，用洗脫液對所述珠子洗脫，對洗脫液進行解交聯處理并用蛋白酶K消化處理。