[發(fā)明專利]一種表征等離子體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)絕對鈣離子濃度的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810120797.7
• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108469427B
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 董曉宇
• 申請（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/44
• 代理公司: 大連八方知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21226
• 代理人: 衛(wèi)茂才

本發(fā)明是一種表征等離子體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)絕對鈣離子濃度的方法。本方法將制備的細(xì)胞懸浮液加入優(yōu)化后的Fluo?3 AM，添加0.8mM Pluronic F?127，獲得最大熒光強(qiáng)度F_max值，或添加鈣離子螯合劑EGTA，獲得最小熒光強(qiáng)度F_min值，制備的細(xì)胞懸浮液加入優(yōu)化后的Fluo?3 AM經(jīng)大氣壓冷等離子體處理，結(jié)合多功能酶標(biāo)儀測定F值，再根據(jù)公式計算出絕對鈣離子濃度。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了熒光探針Fluo?3 AM結(jié)合多功能酶標(biāo)儀測定細(xì)胞絕對鈣離子濃度的方法，該方法具有靈敏、高效、簡便、精確測定和表征細(xì)胞內(nèi)鈣離子絕對濃度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度定量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種表征等離子體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)絕對鈣離子濃度的方法。

背景技術(shù)

鈣離子作為重要的第二信使，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)并調(diào)控一系列生命活動。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在一定范圍內(nèi)(1～10μM)，有助于微生物生長和產(chǎn)物形成，但是鈣離子濃度過高會抑制菌體生長，甚至促進(jìn)菌體死亡。大氣壓冷等離子體作為一種強(qiáng)化技術(shù)，通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，達(dá)到強(qiáng)化微生物轉(zhuǎn)化目標(biāo)產(chǎn)物的能力。目前常用細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定方法存在諸多限制因素，無法精確表征與微生物高轉(zhuǎn)化力相匹配的胞內(nèi)鈣離子濃度。

目前，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較為簡潔的測定方法為化學(xué)熒光探針技術(shù)，如利用單波長激發(fā)熒光探針Fluo-3和比率型熒光探針FuraRed，或二者結(jié)合使用，通過共聚焦顯微鏡測定熒光強(qiáng)度，采用單一熒光探針的熒光強(qiáng)度或上述兩種探針熒光強(qiáng)度比率來表征細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子濃度。但是，這種表征方法測定的均為鈣離子的相對濃度。到目前為止，直接而精確的絕對鈣離子濃度測定方法并未見報道。因此，建立精確測定和表征細(xì)胞內(nèi)鈣離子絕對濃度的方法是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種表征等離子體誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)絕對鈣離子濃度的方法，可以精確測定和表征細(xì)胞內(nèi)鈣離子絕對濃度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種表征等離子體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)絕對鈣離子濃度的方法，所述方法包括以下步驟：

步驟1，制備細(xì)胞懸浮液；

步驟2，優(yōu)化Fluo-3 AM使用條件

(1)水浴溫度和孵育時間優(yōu)化

將步驟1制備的細(xì)胞懸浮液加入Fluo-3 AM，選取水浴溫度30℃～44℃，孵育時間0min～120min處理，處理后的菌液進(jìn)行細(xì)胞存活率分析選取最優(yōu)；

(2)探針Fluo-3 AM終濃度和孵育時間優(yōu)化

將步驟1制備的細(xì)胞懸浮液加入Fluo-3 AM，選取探針Fluo-3 AM終濃度0～12μM，孵育時間0～215min處理，使用多功能酶標(biāo)儀檢測處理后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并計算得到相對熒光強(qiáng)度，相對熒光強(qiáng)度最高的為最優(yōu)；

(3)探針裝載順序優(yōu)化

先等離子體處理—后裝載探針和先裝載探針—后等離子體處理，這兩種順序?qū)?xì)胞活性及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定沒有影響；

步驟3，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)絕對鈣離子濃度測定

步驟1制備的細(xì)胞懸浮液加入步驟2優(yōu)化條件下的Fluo-3 AM，添加0.8mMPluronicF-127，獲得最大熒光強(qiáng)度F_max值；或添加鈣離子螯合劑EGTA，濃度范圍為0～30nM，獲得最小熒光強(qiáng)度F_min值；

步驟1制備的細(xì)胞懸浮液經(jīng)大氣壓冷等離子體處理后加入步驟2優(yōu)化條件下Fluo-3 AM或步驟1制備的細(xì)胞懸浮液先加入步驟2優(yōu)化條件下的Fluo-3 AM再經(jīng)大氣壓冷等離子體處理，獲得F值，根據(jù)公式(1)，