[發明專利]一種表征等離子體誘導細胞內絕對鈣離子濃度的方法

有效

• 申請號: 201810120797.7
• 申請日: 2018-02-07
• 公開（公告）號: CN108469427B
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 董曉宇
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/44
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司 21226
• 代理人: 衛茂才

1.一種表征等離子體誘導細胞內絕對鈣離子濃度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟1，制備細胞懸浮液；

步驟2，優化Fluo-3 AM使用條件

(1)水浴溫度和孵育時間優化

將步驟1制備的細胞懸浮液加入Fluo-3 AM，選取水浴溫度30℃～44℃，孵育時間0min～120min處理，處理后的菌液進行細胞存活率分析選取最優；

(2)探針Fluo-3 AM終濃度和孵育時間優化

將步驟1制備的細胞懸浮液加入Fluo-3 AM，選取探針Fluo-3 AM終濃度0～12μM，孵育時間0～215min處理，使用多功能酶標儀檢測處理后細胞的熒光強度，并計算得到相對熒光強度，相對熒光強度最高的為最優；

(3)探針裝載順序優化

先等離子體處理—后裝載探針和先裝載探針—后等離子體處理，這兩種順序對細胞活性及細胞內鈣離子濃度測定沒有影響；

步驟3，細胞質內絕對鈣離子濃度測定

將步驟1制備的細胞懸浮液加入步驟2優化條件下的Fluo-3 AM，添加0.8mM PluronicF-127，獲得最大熒光強度F_max值；或添加鈣離子螯合劑EGTA，濃度范圍為0～30nM，獲得最小熒光強度F_min值；

將步驟1制備的細胞懸浮液經大氣壓冷等離子體處理后加入步驟2優化條件下的Fluo-3AM或步驟1制備的細胞懸浮液先加入步驟2優化條件下的Fluo-3 AM再經大氣壓冷等離子體處理，獲得F值，根據公式(1)，

已知K_d＝325nm為解離常數，計算即可得到細胞內絕對鈣離子濃度；其中，F_max值、F_min值、F值均使用多功能酶標儀測定。

2.如權利要求1所述的表征等離子體誘導細胞內絕對鈣離子濃度的方法，其特征在于：所述細胞為植物細胞、動物細胞、微生物細胞。

3.如權利要求1所述的表征等離子體誘導細胞內絕對鈣離子濃度的方法，其特征在于，步驟1具體為：

收集培養至對數期的菌液，4℃離心、30000×g、5min，棄上清，重懸于新鮮2％YPD培養液，調整菌體濃度OD₆₀₀至6.0，此時細胞濃度是5×10⁵個/mL。

4.如權利要求1所述的表征等離子體誘導細胞內絕對鈣離子濃度的方法，其特征在于，步驟3優化Fluo-3 AM使用條件具體為：

(1)水浴溫度和孵育時間優化

將步驟1制得的細胞懸浮液分裝于1.5mL離心管中，每管1mL，共6管，每6管為1組，每組分別于30℃、37℃、44℃條件下水浴處理0min、20min、40min、60min、80min、100min、120min，每隔7min上下顛倒幾次混勻菌液；處理后的菌液進行細胞存活率分析，選取最優探針Fluo-3 AM孵育溫度37℃；

(2)探針Fluo-3 AM終濃度和孵育時間優化

將步驟1制得的細胞懸浮液分為7組，向1～7組菌液中分別加入1mM Fluo-3 AM母液0、1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4μL，至終濃度為0、2、4、6、8、10、12μM；充分混合，于37℃水浴條件下孵育55min，期間每隔5min上下顛倒幾次混勻；孵育完成后離心收集菌體(6000rpm，4℃，10min)，PBS洗滌三次，加700μL PBS重懸；使用多功能酶標儀檢測每組細胞的熒光強度，并計算得到相對熒光強度，選取最優探針Fluo-3 AM終濃度為6μM；

將步驟2制得的細胞懸浮液分為12組，將1～12組混合探針的細胞懸浮液于37℃水浴條件下分別孵育0～215min，每組間隔20min，孵育完成后離心收集菌體(6000rpm，4℃，10min)，PBS洗滌三次，加700μL PBS重懸；使用多功能酶標儀檢測每組細胞的熒光強度，并計算得到相對熒光強度，選取最優孵育時間為135min。

5.如權利要求1所述的表征等離子體誘導細胞內絕對鈣離子濃度的方法，其特征在于，步驟2所述優化條件為：探針Fluo-3 AM孵育溫度37℃，探針Fluo-3AM終濃度為6μM，孵育時間為135min。