[發(fā)明專利]一種榧樹EST-SSR引物及品種指紋圖譜構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810119231.2
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN108359738B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張敏;張遲;陳燾;金平;戴文圣
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué);景寧嘉樹農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發(fā)明屬于分子指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種榧樹EST?SSR引物及品種指紋圖譜構(gòu)建方法，序列為：SEQ ID NO：1?SEQ ID NO：40。篩選所得的20個多態(tài)性EST?SSR標記，對13個榧樹品種的DNA進行PCR擴增；根據(jù)擴增結(jié)果，精確讀取擴增片段長度，進行統(tǒng)計后，最少使用三對EST?SSR引物組合將供試的13個榧樹品種區(qū)分開。本發(fā)明基于‘細榧’和‘圓榧’種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對獲得的SSR數(shù)據(jù)進行分析，篩選出擴增條帶清晰，且多態(tài)性高的SSR引物，并利用其構(gòu)建榧樹特色品種的分子指紋圖譜，同時為榧屬種質(zhì)資源評價、保存和利用提供了良好的基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種榧樹EST-SSR引物及品種指紋圖譜構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

榧屬(Torreya)由Arnott于1938年創(chuàng)立，佛羅里達榧(Torreya taxifolia Arn)為該屬的模式植物。據(jù)文獻記載，現(xiàn)存榧屬植物僅有7種2變種，間斷分布于東亞和北美洲。其中，佛羅里達榧(Torreya taxifolia)和加州榧(Torreya californica Torrey)產(chǎn)于北美，日本榧(Torreya nucifera(L.)Sieb.et Zucc.)野生分布于日本和朝鮮半島，我國部分城市作為庭院樹引種栽培。中國自然分布有巴山榧 (Torreya fargesii Franch.)、長葉榧(Torreya jackii Chun)、榧樹(Torreya grandis Fort.ex Lind)、四川榧(Torreyaparvifolia Yi,L Yang et Long)、云南榧(Torreya fargesii Franch.Var.yunnanensis)和九龍山榧(Torreya grandis Fort.ex Lind.Var. jiulongshanensis)。還有一種榧屬植物Torreya clarnensis已滅絕，在美國俄勒岡州中北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)了它的種子化石，這批種子化石位于始新世中期的黑硅石中。榧樹(Torreya grandis)通常雌雄異株，群體內(nèi)變異復(fù)雜，籽形從圓到長，從大到小呈正態(tài)分布。會稽山區(qū)的榧樹類型最為豐富，不同類型的民間稱謂有：細榧，芝麻榧，米榧，茄榧，獠牙榧，旋紋榧，大圓榧(炭甏榧)，圓榧，小圓榧，寸金榧，羊角榧，長榧和沖杠榧等。在安徽省黃山地區(qū)有神仙榧，花生榧，和尚榧，糯米榧，轉(zhuǎn)筋榧，蘋果榧，牛卵子榧，圓榧，小圓榧和米榧等品種類型的稱謂。2011年，‘細榧’(Torreya grandis‘Xifei’)通過國家林業(yè)局林木品種審定委員會審定，良種編號“國S-SV-TG-024-2011”。近年來，浙江省林木品種審定委員會審(認)定了‘珍珠榧’，‘大長榧’，‘象牙榧’，‘東白珠’，‘脆仁榧’，‘朱巖榧’，‘丁山榧’，‘東榧1號’，‘東榧2號’，‘東榧3號’和‘大葉種細榧’等品種。目前，香榧造林中所應(yīng)用的苗木基本來自于育苗農(nóng)戶和部分企業(yè)，存在著苗木品種不明確，未使用審(認)定品種作為接穗育苗的情況，導(dǎo)致部分造林企業(yè)和農(nóng)戶在購買苗木種植10多年后，出現(xiàn)香榧樹不結(jié)實或所結(jié)種實不是購買的品種。香榧在苗期基本無法通過形態(tài)學(xué)特征來區(qū)分品種，因此隨著榧樹新品種的不斷選育和香榧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大，香榧品種急需通過構(gòu)建DNA指紋圖譜來加以鑒定，以便保護育種者及種植者的權(quán)益；榧樹各居群的實生種質(zhì)需要進行評價和利用；分子標記輔助選擇育種也勢在必行。簡單序列重復(fù)(SimpleSequence Repeat,SSR)又稱微衛(wèi)星序列，是廣泛存在于真核和原核生物基因組中的遺傳標記，具有共顯性、覆蓋性廣、信息量大、操作簡單等優(yōu)勢，SSR標記已廣泛應(yīng)用于油茶、陸地棉、油棕、花生等油料植物的遺傳多樣性評價和品種指紋圖譜構(gòu)建。傳統(tǒng)的SSR引物主要從基因組文庫中獲得，其步驟復(fù)雜、工作量大，開發(fā)成本高。近年來，高通量測序技術(shù)迅猛發(fā)展，EST-SSR是ESTs測序計劃的副產(chǎn)物，開發(fā)成本較低，共顯性遺傳，多態(tài)性高，重復(fù)性及穩(wěn)定性好，是目前最適合用于種質(zhì)鑒定分析的標記之一。在榧屬植物分子標記開發(fā)方面，金則新等建立了長葉榧ISSR-PCR的反應(yīng)體系，梁丹等人建立了香榧AFLP實驗體系并利用AFLP進行了榧樹雌雄株的鑒定，劉浩凱等利用SRAP標記研究了雌性榧樹4個居群的遺傳多樣性，戴正等用RAPD和 SCAR標記鑒定了香榧幼苗的性別，張黨權(quán)等利用RAPD將榧樹的幾個栽培類型進行了分類。