[發(fā)明專利]一種榧樹EST-SSR引物及品種指紋圖譜構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810119231.2
• 申請(qǐng)日: 2018-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN108359738B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張敏;張遲;陳燾;金平;戴文圣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué);景寧嘉樹農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種榧樹EST-SSR引物，其特征在于，所述榧樹EST-SSR引物序列為：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：40；

所述榧樹EST-SSR引物的制備方法包括：

對(duì)細(xì)榧和圓榧不同發(fā)育時(shí)期的種仁進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用Primer3程序?qū)蠸SR位點(diǎn)的Unigene序列設(shè)計(jì)引物；引物長(zhǎng)度控制在20bp；退火溫度58℃-62℃；上下游引物的Tm值相差不大于2℃；PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度100-300bp；GC含量40%-60%；每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生3對(duì)候選引物；選取巴山榧，九龍山榧，長(zhǎng)葉榧，日本榧，榧樹作為模版對(duì)合成的EST-SSR進(jìn)行篩選；

PCR擴(kuò)增采用10μL體系，其中包括10× PCR Buffer Mg²⁺ 1μL，dNTP Mix 0.8 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模版0.5 μL，rTaq酶0.05μL，ddH₂O 6.65μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行30次循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45 s，54-58℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min，4℃保存。