[發明專利]一種基于大腸埃希氏菌快速篩選電子煙液的方法

有效

• 申請號: 201810119217.2
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN108315385B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 米其利;高茜;段沅杏;趙偉;鞏效偉;樓牧夢;劉曉艷;郭紹翠;夭建華
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12Q1/10;C12Q1/06;C12R1/19
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生;羅繼元

1.一種基于大腸埃希氏菌快速篩選電子煙液的方法，其特征在于：該方法將體外抑菌檢測法和煙液調配組合，用于短時間篩選電子煙液，具體步驟如下：

（1）受試電子煙液樣品的制備

稱取基礎電子煙液樣品10.0g，根據感官評吸效果確定植物提取物的添加量，添加量范圍0.01～0.50g，對照組為基礎電子煙液；

（2）抑菌活性的測定

1）菌株活化培養：自液氮罐中取出凍存的菌株，置于37℃水浴中快速融解得到復蘇菌液；將復蘇菌液以1.0%v/v的比例接種于滅菌營養肉湯培養基中，置于恒溫水浴搖床中36℃，120rpm培養16～20h，獲得第1次活化菌液；再將第1次活化菌液以1.0%v/v的比例接種

于滅菌營養肉湯培養基中，然后置于恒溫水浴搖床中36℃，120rpm培養16～20h，得到第2次活化菌液；

2）菌液濃度測定：

（a）取1mL第2次活化菌液，加入9mLPBS緩沖液，制成1:10的菌菌懸液；

（b）按照（a）的操作，制備10倍系列稀釋菌懸液；

（c）選取上述10倍系列稀釋菌懸液中的3個稀釋度，取1mL加入無菌平板中，然后加入20mL營養肉湯瓊脂培養基，混合均勻，置于隔水式恒溫培養箱中36℃培養16～20h后，計數平板上的菌落數，乘以稀釋倍數計算得到第2次活化菌液的濃度；

3）測試菌懸液制備：根據第2次活化菌液濃度，計算并在雙倍濃度營養肉湯培養基中加入第2次活化菌液，制成測試菌懸液，大腸埃希氏菌濃度為10⁴-10⁶CFU/mL；

4）加樣：在無菌96孔培養板上設置對照組、空白組和實驗組；對照組和空白組中加入100μLPBS緩沖液，實驗組加入100μL不同稀釋倍數的電子煙液；空白組中加入100μL雙倍濃度營養肉湯培養基，對照組和實驗組中加入100μL測試菌懸液，每組6孔平行；

5）培養：將96孔培養板置于隔水式恒溫培養箱中，36℃培養16～20h；

6）MTT孵育：取出培養后的96孔培養板，置于微孔板離心機10 ,000 rpm室溫離心5min，棄掉上清液；加入1.5～2.0mg/mL的MTT溶液，100μL/孔，置于微孔板振蕩器上36℃振蕩5min，然后置于36℃隔水式恒溫培養箱內孵育1.0～1.5h；

7）吸光值測定：取出孵育后的96孔培養板，置于微孔板離心機10 ,000 rpm室溫離心5min，棄掉上清液；加入DMSO，200μL/孔，置于微孔板振蕩器上36℃振蕩5min；靜置后，置于酶標儀上測定570nm下對照組、空白組和實驗組吸光值的吸光值；

（3）抑菌活性計算

電子煙液的抑菌活性采用抑菌率I表示，根據吸光值，按照公式（1）計算，公式如下：

（1）

式中：I—抑菌率；ODn—實驗組的平均吸光值；ODo—空白組的平均吸光值；ODc—對照組的平均吸光值。