[發(fā)明專利]一種體外擴增和規(guī)模化培養(yǎng)間充質干細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810115674.4
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN108103015A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 孟小銳
• 申請（專利權）人: 寧波東錢湖旅游度假區(qū)靖芮醫(yī)療美容診所有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種體外擴增和規(guī)模化培養(yǎng)間充質干細胞的方法，包括以下具體步驟：步驟一：臍帶處理：將臍帶用D?Hank’s液沖洗3～5次后用剪刀剪碎成約0.7～1.0mm3的小塊；步驟二：消化：將步驟一中所制得的臍帶塊加入0.1％膠原酶Ⅱ消化30～35分鐘，然后再加入0.25％胰酶進行消化30～35分鐘。本發(fā)明通過選取新生兒所產生的臍帶，可以將臍帶變廢為寶，同時臍帶間充質干細胞病毒感染機會小，對供者和患者無不良影響，而且間充質干細胞增值能力強，為建立間充質干細胞庫提供了良好的基礎，同時各個步驟中外界條件和時間容易監(jiān)控和控制，避免了不良環(huán)境對培養(yǎng)和擴增造成影響，從而保證了間充質干細胞的生長過程免受外界影響，以此提高間充質干細胞的培養(yǎng)和擴增速率。

技術領域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)和擴增技術領域，特別涉及一種體外擴增和規(guī)模化培養(yǎng)間充質干細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞是一類多能干細胞，因其在造血干細胞移植、移植物抗宿主病等中具有重要作用，目前成為干細胞研究的熱點。目前間充質干細胞的主要來源為成人骨髓，但成人骨髓源間充質干細胞細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且供者間充質干細胞的采集須行骨髓穿刺術，來源受到限制，從而使間充質干細胞的臨床應用受到限制。因此，發(fā)明一種體外擴增和規(guī)模化培養(yǎng)間充質干細胞的方法來解決上述問題很有必要。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種體外擴增和規(guī)模化培養(yǎng)間充質干細胞的方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種體外擴增和規(guī)模化培養(yǎng)間充質干細胞的方法，包括以下具體步驟：

步驟一：臍帶處理：將臍帶用D-Hank’s液沖洗3～5次后用剪刀剪碎成約0.7～1.0mm3的小塊；

步驟二：消化：將步驟一中所制得的臍帶塊加入0.1％膠原酶Ⅱ消化30～35分鐘，然后再加入0.25％胰酶進行消化30～35分鐘；

步驟三：離心：將步驟二中的溶液倒入離心機中，離心機離心20～25分鐘，然后取中間白膜層，并且加入PBS洗滌2次；

步驟四：培養(yǎng)：將步驟三洗滌后的細胞接種于20％～40％胎牛血清培養(yǎng)液Ⅰ中，然后置于37℃、5％二氧化碳和飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，靜置2～3天；

步驟五：培養(yǎng)液更換：將步驟四中靜置2～3天后的培養(yǎng)液Ⅰ內的培養(yǎng)液進行更換，并且去除非貼壁細胞，同時每隔2～3天進行換液一次；

步驟六：消化：在步驟五進行之后，將培養(yǎng)液放置于顯微鏡下觀察，當觀測到待貼壁細胞80％～90％后，加入0.25％胰酶消化；

步驟七：傳代培養(yǎng)：用吸管從步驟六消化后的溶液中吸取適量的細胞，并且以2*104/ml密度接種于20％～40％胎牛血清培養(yǎng)液Ⅱ中進行傳代培養(yǎng)，置于37℃、5％二氧化碳和飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，靜置2～3天，然后進行步驟五和步驟六，以此類推。

優(yōu)選的，步驟一中臍帶為剛剛出生的新生兒所產生的臍帶，剪刀經過300℃～500℃高溫滅菌去除剪刀表面的細菌。

優(yōu)選的，步驟二中是在無菌條件下進行。

優(yōu)選的，步驟三中離心機以2000r/min進行離心運動。

優(yōu)選的，步驟四和步驟七中胎牛血清培養(yǎng)液中還含有100kU/L青霉素和100mg/L鏈霉素。

優(yōu)選的，步驟五中的處理的非貼壁細胞通過收集箱進行集中收集。

本發(fā)明的技術效果和優(yōu)點：