[發明專利]一種用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法

在審

• 申請號: 201810114701.6
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN108267598A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 陰建友;鐘理;劉薇;沈磊;方閃閃
• 申請（專利權）人: 河北省健海生物芯片技術有限責任公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574;G01N33/533
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種用于篩查肺癌的蛋白芯片的制備方法，通過構建吸煙者肺癌組織T7噬菌體展示cDNA文庫，將文庫中的cDNA片段插入到T7噬菌體載體中，使插入片段以融合蛋白形式展示在噬菌體外殼蛋白上，將外源蛋白或多肽基因與噬菌體特定蛋白基因在其表面進行融合表達，通過生物淘洗和噬菌體展示技術制備了蛋白芯片，將病人的異常基因融合表達為異常蛋白，并借助蛋白芯片的高通量篩選和抗原抗體特異性結合的原理來確定腫瘤標志物，本發明的方法可在早期發現或篩查原發腫瘤，篩查腫瘤高危人群，鑒別腫瘤的良惡性，判斷腫瘤的發展過程，觀察腫瘤的治療效果，預測腫瘤的復發和預后中發揮重要作用。

技術領域

本發明涉及一種用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法。

背景技術

一直以來，吸煙被認為是誘發肺癌的首要危險因素，因此，研究人員一直在探索吸煙誘發肺癌的機理，并試圖尋找可以作為吸煙人群肺癌風險預測的標志物，早在上世紀末，研究者們就對吸煙人群中的分子變化進行了研究，結果顯示，在吸煙以及曾經吸煙但并未診斷出肺癌的人群中，p53基因變異以及甲基化已呈現出明顯趨勢，變化程度分別可達到70％和100％，Church等也在2009年首次利用血清中煙草特異性致癌物對吸煙人群的肺癌患病風險性進行了研究，結果顯示，NNAL(煙草甲基亞硝胺)是所有檢測指標中唯一一個與肺癌危險性相關的標志物，并且還可以明顯區分腺癌與非腺癌患者，另外，對吸煙正常人與非吸煙正常人之間對比發現，24h的尿液中尼古丁和NNAL兩種標志物的檢測濃度在吸煙樣本中顯示明顯的特異性，表明這兩種標志物具有區分吸煙與非吸煙人群的特性。

近年來，為了探索漢族人群中肺癌風險相關基因，我國科研人員通過全基因組關聯研究(GWAS)，在中國漢族人群中鑒定出了與肺癌相關的4個新位點，在此研究中，研究人員對上萬例樣本進行檢測，鑒定出了4個與肺癌相關聯的風險位點，其中13q12.12和22q12.2為漢族人群中的新發風險位點，這項研究結果表明肺癌易感人群在基因水平上的差異性，為本研究在蛋白抗體水平尋找易感人群的差異提供了理論依據。

自身免疫抗體作為免疫監視原理的產物，具有早期檢測癌癥發生與發展過程的能力，是近年癌癥早期診斷標志物的研究方向，1998年，Mitsudomi T等人對NSCLC患者血清中p53蛋白的自身免疫抗體水平進行了研究，提出p53蛋白AAb可能具有一定的診斷價值，此后對于腫瘤AAb的研究得到了更廣泛的認識，Pereira-Faca等對早期肺癌細胞系中PGP9.5、膜連蛋白Ⅰ和14-3-3theta三者進行聯合檢測發現敏感性提高到55％，而特異性為95％，這些研究體現出了AAb聯合篩查在早期肺癌檢測中的優勢，Rom等人在2010年報道了運用自身免疫抗體對肺癌患者、肺部有磨玻璃狀陰影吸煙者、良性固體結節吸煙者、CT正常吸煙者以及正常非吸煙者血清進行了比對檢測，結果表明，c-myc，CyclinA，Cyclin B1，Cyclin D1，CDK2和Survivin自身抗體組合能夠明顯區分肺癌中的吸煙人群與非吸煙人群，敏感性為81％，特異性為97％，但該組合尚不具備對吸煙人群中肺癌發生風險預測的能力，也沒能用于肺癌早期篩查的功能。

隨著對蛋白質組學研究的不斷深入，高通量蛋白芯片技術、電離質譜、qRT-PCR等技術已經發展為腫瘤標志物開發及癌癥早期篩查中的重要實驗手段，本課題組利用蛋白芯片與cDNA噬菌體展示相結合的技術，篩選出由5個NSCLCAAb所組成的標志物組合，其對早期NSCLC的診斷敏感性和特異性都達到91.3％，且ROC(Receiver O peratingCharacteristics)曲線下面積達到0.99，甚至可以對潛伏期NSCLC實現83％的檢測準確率，利用電離質譜技術，Yildiz等篩選出7個蛋白標志物組合模型，特異性達86％，但敏感性只有58％，最新的研究結果顯示，MicroRNA作為血清檢測指標在肺癌早期篩查中的效果相對較理想，Chen等利用qRT-PCR方法對10個miRNA標簽進行檢測，診斷敏感性為93％，特異性為90％，而Wu及其研究小組對血清中自身免疫抗體的檢測結果顯示，6種自身免疫抗體對早期肺癌的診斷敏感性和特異性都達到92％。