[發明專利]一種用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法

在審

• 申請號: 201810114701.6
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN108267598A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 陰建友;鐘理;劉薇;沈磊;方閃閃
• 申請（專利權）人: 河北省健海生物芯片技術有限責任公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574;G01N33/533
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)建立癌組織cDNA噬菌體展示文庫：

選擇病理資料齊全的若干份癌組織，包括一半的I期及一半的II期癌組織，提取得到總RNA，然后分離得到mRNA；

將mRNA作為模板，制備得到兩端分別有EcoRI和Hind III粘性末端的雙鏈cDNA；

將上述獲得的雙鏈cDNA與噬菌體混合，在連接酶的作用下，取連接產物與包裝蛋白混合，得到大量具有感染性的噬菌體顆粒，擴增，形成癌組織cDNA噬菌體文庫；

(2)生物淘洗：

通過親和選擇獲得靶功能的蛋白或者多肽，進而作為標志物進行開發應用，即從上述文庫中獲得噬菌體展示文庫；

2.1G蛋白珠封閉：

取兩個離心管，分別加入G蛋白瓊脂糖珠，用BSA封閉，標記1、2號管；

2.2血清包被：

將若干份正常人血清混合，稀釋后，用其包被1號管，4℃放置1h，將若干份癌病人血清混合，稀釋后，包被2號管，4℃放置1h；之后用PBS清洗，離心去上清；

2.3生物淘洗：

向1號管中加入上述構建的噬菌體文庫，將其混合均勻，離心，收集懸浮液，備用，2h后用PBS洗2號管G蛋白瓊脂糖珠3次，離心，去上清，將之前步驟收集的懸浮液加入2號管中，混合均勻，4℃放置，然后離心去上清，再用PBS洗脫，離心，收集懸浮液，即為免疫原性噬菌體；

2.4淘洗后的富集

將淘洗后得到的免疫原性噬菌體加入到BLT5615中，混合均勻，37℃倒置培養，長出噬菌斑；加入噬菌斑提取液，過夜，收集噬菌斑提取液，離心，保存上清；

重復進行多輪淘洗、擴增，將最后一輪擴增后的噬菌體-80℃儲存，備用。

2.5cDNA文庫的稀釋鋪板；

將最后一輪淘洗后的文庫一系列梯度稀釋，稀釋多個梯度，取稀釋后的多個文庫分別與備用的宿主菌混合，鋪板，37℃倒置培養，直到長出清晰的噬菌斑后，4℃保存；

(3)芯片構建與高通量篩選：

3.1芯片的構建：

在孔板中加入BLT 5615菌液，用滅菌牙簽挑取單克隆到孔板中，置于搖床培養，離心，分別從每孔中取上清于一新的孔板，用于點樣，使用自動點樣儀，設置矩陣和間距后進行取樣、點樣，得若干張蛋白芯片。

2.根據權利要求1所示的用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法，其特征在于：使用PolyATtract mRNAIsolation SystemⅢ分離得到mRNA。

3.根據權利要求1或2所示的一種用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法，其特征在于：分別構建了正常人群與吸煙肺癌相關的cDNA文庫。

4.根據權利要求1所示的用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法，其特征在于：通過生物淘洗獲得了具有吸煙肺癌免疫原性的噬菌體文庫。

5.根據權利要求1所示的用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法，其特征在于：所述芯片的構建過程中使用的芯片為硝酸纖維素膜玻片。

6.根據權利要求1所示的用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法，其特征在于：所述蛋白芯片由自動點樣儀點制，是由多個亞陣列組成的微陣列芯片。

7.根據權利要求1所示的用于肺癌篩查的蛋白芯片的制備方法，其特征在于：所述蛋白芯片的檢測腫瘤標志物的技術為雙熒光檢測體系。