[發(fā)明專利]一種單輸入多輸出的基因回路、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810114254.4
• 申請日: 2018-02-05
• 公開（公告）號: CN110117614A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡亮;楊子杰
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 上海唯智贏專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31293
• 代理人: 吳瑾瑜

1.一種單輸入多輸出的基因回路，其特征在于，包括N個(gè)模塊，N的數(shù)量為大于等于1的整數(shù)，每個(gè)模塊具有3個(gè)子模塊，每個(gè)子模塊為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，各模塊的結(jié)構(gòu)包括:

第X.1子模塊包括激活型啟動子，連接2個(gè)不同的抑制型轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列，這2個(gè)抑制性轉(zhuǎn)錄因子具有不同的抑制閾值，以及第X.1功能蛋白的編碼序列；

第X.2子模塊的結(jié)構(gòu)為，含有具有低抑制閾值的抑制型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的合成啟動子、具有高抑制閾值的抑制型轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列、第X.2功能蛋白的編碼序列；

第X.3子模塊的結(jié)構(gòu)為，含有具有高抑制強(qiáng)度的抑制型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的合成啟動子和第X.3功能蛋白的編碼序列；

X＝1～N的整數(shù)；

第X.2與X.3子模塊的合成啟動子為抑制型啟動子；

第X.2和第X.3子模塊中合成啟動子的抑制閾值不同，且具有正交性。

2.權(quán)利要求1所述單輸入多輸出的基因回路，其特征在于，各模塊的合成啟動子中，所含抑制型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的拷貝數(shù)為1～20個(gè)。

3.權(quán)利要求1所述單輸入多輸出的基因回路，其特征在于，每個(gè)模塊第X.1～第X.3子模塊分別編碼三組不同的功能蛋白；或者，其中有一個(gè)為空白，其余的編碼兩組不同的功能蛋白；每組功能蛋白的數(shù)量為一個(gè)或多個(gè)。

4.權(quán)利要求1或3所述單輸入多輸出的基因回路，其特征在于，所述的功能蛋白為細(xì)胞因子、免疫球蛋白超家族成員、依賴酶活實(shí)現(xiàn)抗菌抗病毒效應(yīng)的蛋白質(zhì)或熒光蛋白。

5.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述單輸入多輸出的基因回路，其特征在于，第X.1子模塊的激活型啟動子所需的激活型轉(zhuǎn)錄因子是響應(yīng)單一抗原輸入后的產(chǎn)物；所述的激活型轉(zhuǎn)錄因子的輸入信號強(qiáng)度與靶細(xì)胞表面抗原密度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，所述的靶細(xì)胞表面抗原為具有免疫球蛋白基礎(chǔ)序列的蛋白或具有明顯胞外片段的跨膜蛋白。

6.權(quán)利要求1或2所述單輸入多輸出的基因回路，其特征在于，模塊的數(shù)量為1個(gè)；第1抑制型轉(zhuǎn)錄因子為PIP，第1.2子模塊合成啟動子含有1～4個(gè)拷貝的PIP結(jié)合DNA；第2抑制型轉(zhuǎn)錄因子為ZF43-8，第1.3子模塊合成啟動子含有4-10個(gè)拷貝的ZF43-8結(jié)合DNA。

7.權(quán)利要求1或2所述的單輸入多輸出的基因回路，其特征在于：模塊的數(shù)量為1個(gè)，第1.1功能基因編碼IL-18，第1.2功能基因?yàn)榭瞻祝?.3模塊的功能基因編碼IL-12。

8.一種表達(dá)載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的單輸入多輸出的基因回路。

9.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，含有權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的單輸入多輸出的基因回路或權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體。

10.權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞通過權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的單輸入多輸出的基因回路實(shí)現(xiàn)對擁有相關(guān)抗原的靶細(xì)胞的、隨抗原密度變化的表達(dá)不同功能蛋白。

11.權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的單輸入多輸出的基因回路或權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體制備癌癥、感染或自身免疫疾病的診斷試劑或者用于制備治療腫瘤、感染或自身免疫疾病的藥物。

12.權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞用于制備治療癌癥、感染或自身免疫疾病的藥物。

13.根據(jù)靶細(xì)胞表面抗原密度驅(qū)動不同功能蛋白表達(dá)的方法，步驟包括：

(1)獲取不同狀態(tài)下靶細(xì)胞表面抗原的密度變化范圍，并篩選對應(yīng)抗原密度變化的輸入胞內(nèi)信號；

(2)選擇差異化響應(yīng)不同輸入信號強(qiáng)度的轉(zhuǎn)錄因子及其DNA結(jié)合序列和拷貝數(shù)，以步驟(1)篩選的信號來啟動表達(dá)激活啟動子對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的單輸入多輸出的基因回路；

(3)用所得的基因回路改造宿主細(xì)胞，使宿主細(xì)胞響應(yīng)靶細(xì)胞表面抗原的密度的變化，表達(dá)不同功能蛋白。