[發(fā)明專利]一種單輸入多輸出的基因回路、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2018-02-05
• 公開（公告）號: CN110117614A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡亮;楊子杰
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 上海唯智贏專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31293
• 代理人: 吳瑾瑜

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種單輸入多輸出的基因回路。這種基因回路通過選擇具有良好正交性及顯著抑制效率差異的兩對抑制型轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合DNA，響應(yīng)細(xì)胞表面抗原密度，根據(jù)輸入信號強(qiáng)度驅(qū)動表達(dá)不同功能蛋白。利用單輸入多輸出基因回路改造效應(yīng)細(xì)胞，可驅(qū)動效應(yīng)細(xì)胞對擁有該抗原的靶細(xì)胞、隨抗原密度變化差異化表達(dá)不同的功能蛋白例如細(xì)胞因子，實(shí)現(xiàn)針對靶細(xì)胞的組合效果。本發(fā)明可提高針對單一抗原的細(xì)胞治療的效率，且兼容于針對多抗原的細(xì)胞治療的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是可根據(jù)單一信號輸入強(qiáng)度產(chǎn)生不同響應(yīng)的基因回路，并用這種基因回路改造宿主細(xì)胞，使之可針對細(xì)胞表面單一抗原的不同密度產(chǎn)生不同的響應(yīng)。

背景技術(shù)

癌癥，因癌細(xì)胞的內(nèi)源性、異質(zhì)性和突變抗藥性而難以治愈。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)，也稱作人工抗原受體(artificial antigenreceptor)，是一類經(jīng)人工改造，由胞外抗原結(jié)合域、跨膜域和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域組成，集特異性識別靶向腫瘤抗原和激活T細(xì)胞兩種作用于一身的T細(xì)胞受體。表達(dá)CAR的T細(xì)胞簡稱CAR-T。T細(xì)胞通過CAR識別腫瘤細(xì)胞表面特定的抗原，即只在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)或高度表達(dá)、在正常體細(xì)胞表面不表達(dá)或者表達(dá)量極低的特異性抗原，從而殺滅癌細(xì)胞。

CAR-T臨床治療，是當(dāng)前最有潛力的癌癥的細(xì)胞療法。與傳統(tǒng)的T細(xì)胞識別抗原相比，CAR繞過了抗原提呈階段，直接識別腫瘤抗原(tumor antigen)，不受MHC(majorhistocompatibility complex，主要組織相容性復(fù)合體)的限制。同時CAR擁有增加的共刺激信號來增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤的殺傷性。但是，CAR-T療法的致命弱點(diǎn)有兩個：一是可能會引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”；二是特異性抗原難找。

基因回路又稱基因電路，是一種以觸發(fā)模式開關(guān)功能的基因電路，可以開關(guān)所選擇的細(xì)胞功能。

Lu等人的”Synthetic RNA-Based Immunomodulatory Gene Circuits forCancer Immunotherapy”公開了一種基于合成RNA的免疫調(diào)節(jié)基因回路，采用“與門”結(jié)構(gòu)，設(shè)計了識別腫瘤標(biāo)記物的特異性啟動子，并由病毒介導(dǎo)將基因回路傳送到癌細(xì)胞內(nèi)；合成的啟動子會與癌細(xì)胞內(nèi)特有蛋白結(jié)合，因此僅在癌細(xì)胞內(nèi)啟動表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物將誘導(dǎo)T細(xì)胞對其殺傷。這是基于基因回路區(qū)分癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的方法，在只有癌細(xì)胞表達(dá)的兩種標(biāo)志物同時刺激下，激活啟動子表達(dá)蛋白引導(dǎo)T細(xì)胞識別和殺傷；正常細(xì)胞不會表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞的蛋白。

以上的各種方法，在實(shí)際應(yīng)用中的難度都在于篩選出特異性的腫瘤抗原；CAR有引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴的風(fēng)險；Lu等人的基因回路需要兩種腫瘤標(biāo)志物，且需要導(dǎo)回癌細(xì)胞內(nèi)。

真核細(xì)胞內(nèi)基因回路的結(jié)果通常采用與/或/非的邏輯門，實(shí)現(xiàn)多輸入多輸出的結(jié)果，尚無根據(jù)單輸入信號強(qiáng)度變化，產(chǎn)生多種輸出結(jié)果的方案。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種單輸入多輸出的基因回路及其應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了含有這類基因回路的表達(dá)載體和細(xì)胞及其應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種根據(jù)靶細(xì)胞表面抗原密度驅(qū)動不同功能蛋白表達(dá)的方法。

一種單輸入多輸出的基因回路，其特征在于，包括N個模塊，N的數(shù)量為大于等于1的整數(shù)，每個模塊具有3個子模塊，每個子模塊為一個轉(zhuǎn)錄單元，各模塊的結(jié)構(gòu)包括:

第X.1子模塊包括激活型啟動子，連接2個不同的抑制型轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列，這2個抑制性轉(zhuǎn)錄因子具有不同的抑制閾值，以及第X.1功能蛋白的編碼序列；

第X.2子模塊的結(jié)構(gòu)為，含有具有低抑制閾值的抑制型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的合成啟動子、具有高抑制閾值的抑制型轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列、第X.2功能蛋白的編碼序列；