[發(fā)明專利]一種制備雄性不育的鱗翅目昆蟲(chóng)的方法及其核酸構(gòu)建物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810111390.8
• 申請(qǐng)日: 2018-02-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110117613B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃勇平;徐霞;何琳;李愷;張忠杰;陳旭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/90;A01K67/033
• 代理公司: 上海恒慧知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 31317
• 代理人: 張寧展

1.一種制備雄性不育的鱗翅目昆蟲(chóng)的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)構(gòu)建Ser2基因敲除核酸構(gòu)建物，其包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：第一sgRNA表達(dá)元件和第二sgRNA表達(dá)元件；所述的第一sgRNA表達(dá)元件包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：U6啟動(dòng)子，第一Ser2基因靶點(diǎn)和polyA；所述的第二sgRNA表達(dá)元件包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：U6啟動(dòng)子，第二Ser2基因靶點(diǎn)和polyA；

2)將步驟1)所述的Ser2基因敲除核酸構(gòu)建物和可表達(dá)Piggybac轉(zhuǎn)座酶的PHA3PIG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)鱗翅目新鮮昆蟲(chóng)卵，孵化，化蛾，得G0代，使G0代自交，獲得G1代；和

3)將步驟2)所述的G1代與表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因鱗翅目昆蟲(chóng)交配，獲得G2代，即得雄性不育的鱗翅目昆蟲(chóng)，所述的鱗翅目昆蟲(chóng)是家蠶。

2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述的第一Ser2基因靶點(diǎn)的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所述的第二Ser2基因靶點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述的Ser2基因敲除核酸構(gòu)建物還包括第一篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒。

4.如權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述的第一篩選標(biāo)記基因是紅色熒光蛋白基因。

5.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述的表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因鱗翅目昆蟲(chóng)含有Cas9基因表達(dá)盒，所述的Cas9基因表達(dá)盒包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：Nos啟動(dòng)子，Cas9蛋白編碼序列和SV40終止子。

6.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述的表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因鱗翅目昆蟲(chóng)還包括第二篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒。

7.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述的共轉(zhuǎn)是將所述Ser2基因敲除核酸構(gòu)建物和可表達(dá)Piggybac轉(zhuǎn)座酶的PHA3PIG質(zhì)粒混合后所得的混合液顯微注射新鮮昆蟲(chóng)卵。

8.一種Ser2基因敲除核酸構(gòu)建物，其特征在于，其包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：第一sgRNA表達(dá)元件和第二sgRNA表達(dá)元件；所述的第一sgRNA表達(dá)元件包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：U6啟動(dòng)子，第一Ser2基因靶點(diǎn)和polyA；所述的第二sgRNA表達(dá)元件包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：U6啟動(dòng)子，第二Ser2基因靶點(diǎn)和polyA；所述的第一Ser2基因靶點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的第二Ser2基因靶點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

9.一種防治鱗翅目害蟲(chóng)的方法，其特征在于，包括以下步驟：將如權(quán)利要求1所述的方法制備而得的雄性不育的鱗翅目昆蟲(chóng)野外放生，通過(guò)與野生鱗翅目昆蟲(chóng)交配，使后代減少，降低種群數(shù)量。