[發明專利]一種制備雄性不育的鱗翅目昆蟲的方法及其核酸構建物

有效

• 申請號: 201810111390.8
• 申請日: 2018-02-05
• 公開（公告）號: CN110117613B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 黃勇平;徐霞;何琳;李愷;張忠杰;陳旭
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;A01K67/033
• 代理公司: 上海恒慧知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 31317
• 代理人: 張寧展

一種制備雄性不育的鱗翅目昆蟲的方法及其核酸構建物。方法包括：構建Ser2基因敲除核酸構建物，其包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：U6啟動子，第一Ser2基因靶點和polyA；U6啟動子，第二Ser2基因靶點和polyA；將所述構建物和可表達Piggybac轉座酶的PHA3PIG質粒共轉鱗翅目新鮮昆蟲卵，得G0代，自交得G1代；和將G1代與表達Cas9蛋白的轉基因鱗翅目昆蟲交配得G2代，即得。本發明利用基于PiggyBac轉座子的CRISPR/Cas9技術成功構建了在不影響正常交配行為的前提下雄性不育的鱗翅目昆蟲，在鱗翅目害蟲通過雄性不育技術進行防治方面具有重要的價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種制備雄性不育的鱗翅目昆蟲的方法及其核酸構建物。

背景技術

家蠶是一種典型的模式經濟昆蟲，是以桑葉為食料、吐絲結繭的經濟昆蟲之一。利用家蠶作為昆蟲害蟲防治特別是鱗翅目害蟲的遺傳防治的研究對象，將在農林業害蟲遺傳防治方面產生重大的影響，而且還將在鱗翅目其他昆蟲中推廣應用。現階段害蟲的生物學防治不育技術大多是使用輻射及四環素誘導，而這兩種不育技術耗時耗力并不能有穩定的遺傳效應品系，而且大多是釋放不育雄蟲來進行害蟲防治，但是這些不育雄蟲相對于野生雄蟲來說，其競爭力較弱，不能進行有效交配。在自然界中，雌性成蟲在交配過程中大多數運動力較低，通過釋放性信息素來吸引雄蟲來交配。因此，研究一種穩定遺傳并可以通過釋放性信息的雌蟲以及下一代雄性的有效不育品系迫在眉睫。

雄性不育一直是害蟲防治的研究熱點，在上世紀50年代早期，美國利用輻射不育技術在人類歷史上首次成功地消滅了螺旋錐蠅(Cochliomyia hominivorax)，在1975年2月，日本通過釋放通過輻射處理的不育瓜實蠅(Bactrocera cucuribitae)使其根絕成功。通過利用四環素調控雌性的剪接因子，可以使雌性特異性致死。雖然輻射和四環素都能誘導不育昆蟲，但是兩者的靶標不育蟲是雌性，不能是雄性。

在昆蟲交配生殖過程中，雄性精液蛋白通過射精行為轉移到雌體內，該雄性精液蛋白對雄性和雌性的生殖成功是必不可少的。雄性精液蛋白能夠影響雄性精子競爭的成功和雌性的生殖力、生育力、壽命及后代存活率等。據研究報道，雄性副性腺蛋白在生殖交配過程中的分泌是可塑的，可在自然選擇下快速進化，且比迄今被認為的更復雜。

發明內容

本發明的目的是鱗翅目昆蟲遺傳不育技術中缺乏雄性不育的鱗翅目昆蟲品系的不足，提供一種制備雄性不育的鱗翅目昆蟲的方法及其核酸構建物。

為此，本發明提供一種制備雄性不育的鱗翅目昆蟲的方法，其包括以下步驟：

1)構建Ser2基因敲除核酸構建物，其包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：第一sgRNA表達元件和第二sgRNA表達元件；所述的第一sgRNA表達元件包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：U6啟動子，第一Ser2基因靶點和polyA；所述的第二sgRNA表達元件包括從5’端到3’端的以下可操作性連接的元件：U6啟動子，第二Ser2基因靶點和polyA；

2)將步驟1)所述的Ser2基因敲除核酸構建物和可表達Piggybac轉座酶的PHA3PIG質粒共轉鱗翅目新鮮昆蟲卵，孵化，化蛾，得G0代，使G0代自交，獲得G1代；和

3)將步驟2)所述的G1代與表達Cas9蛋白的轉基因鱗翅目昆蟲交配，獲得的G2代，即得雌雄高度不育的鱗翅目昆蟲。

優選的，所述的第一Ser2基因靶點的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的第二Ser2基因靶點的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

優選的，所述的Ser2基因敲除核酸構建物還包括第一篩選標記基因表達盒。

優選的，所述的第一篩選標記基因是紅色熒光蛋白基因。