[發(fā)明專利]一種帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)載體pGH19-EGFP及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810109496.4
• 申請(qǐng)日: 2018-02-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110117612A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙春青;盛成旺;賈忠強(qiáng);黃秋堂;韓召軍;劉澤文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66;G01N33/68;C07K1/14
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 杜靜;徐冬濤

本發(fā)明公開(kāi)了一種帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的可用于非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的載體pGH19?EGFP及應(yīng)用，通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)pGH19質(zhì)粒進(jìn)行改造，開(kāi)發(fā)成一種含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)簽且適合非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的載體pGH19?EGFP。該載體既可正常表達(dá)目的基因，又可通過(guò)熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡檢測(cè)帶有綠色熒光標(biāo)簽的靶蛋白的分布情況和表達(dá)模式，為非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的蛋白情況提供更直觀簡(jiǎn)潔的檢測(cè)方式；可以實(shí)時(shí)觀察蛋白表達(dá)的時(shí)空動(dòng)態(tài)；對(duì)于目的蛋白后期的提取、純化、鑒定和功能性分析，僅需使用通用型抗體即可檢測(cè)到靶標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及基因工程領(lǐng)域。具體來(lái)說(shuō)，涉及一種帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)載體及應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲爪蟾卵母細(xì)胞是一種功能強(qiáng)大、適用范圍廣的異源性表達(dá)體系，被廣泛應(yīng)用于外源性鈣離子通道、鉀離子通道、鈉離子通道、γ-氨基丁酸受體、谷氨酸受體、乙酰膽堿受體等異源蛋白的表達(dá)及其生理學(xué)和藥理學(xué)特性的研究，它在探討化合物的作用機(jī)制、評(píng)價(jià)和篩選靶標(biāo)化合物的藥效和安全性等方面發(fā)揮著重要作用，是生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)藥學(xué)等領(lǐng)域研究中不可或缺的異源性表達(dá)系統(tǒng)。

綠色熒光蛋白(GFP)是一種在藍(lán)光激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)，已經(jīng)作為一種新型報(bào)告基因在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域中得到應(yīng)用。GFP的突變體增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)，能夠發(fā)射出強(qiáng)度比GFP高6倍以上的熒光，因此被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、調(diào)控、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)的體內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等研究。

pGH19質(zhì)粒是一種含有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)且應(yīng)用廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)載體，因其啟動(dòng)子和終止子附近分別含有非洲爪蟾β-球珠蛋白的5’UTR和3’UTR堿基序列，能夠在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中成功地表達(dá)異源性蛋白質(zhì)，所以被廣泛應(yīng)用于非洲爪蟾卵母細(xì)胞的異源表達(dá)研究。

利用pGH19質(zhì)粒在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)可通過(guò)電生理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其生理學(xué)和藥理學(xué)特性，但是不能在顯微鏡下觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)與否及時(shí)空表達(dá)動(dòng)態(tài)，無(wú)法進(jìn)行有效的亞細(xì)胞定位和目的蛋白的純化及鑒定，而針對(duì)目的蛋白特異性抗體的獲取也需要消耗大量的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)載體pGH19-EGFP，該載體既可以在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中成功表達(dá)有活性的目的蛋白，又帶有可直接鏡檢的綠色熒光，能夠?qū)Φ鞍椎谋磉_(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和亞細(xì)胞定位，并可利用通用型抗體anti-EGFP對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化和檢測(cè)，從而免去制備特異性抗體的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)載體pGH19-EGFP，其特征在于該載體為帶有修飾序列的EGFP基因連接到pGH19質(zhì)粒上獲得；所述帶有修飾序列的EGFP基因?yàn)镋GFP基因5’端加入限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別堿基序列和一段人工設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)堿基序列，及3’端自身攜帶的限制性內(nèi)切酶B的識(shí)別堿基序列。

所述人工設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)堿基序列如SEQ ID NO.2所示，通過(guò)添加該序列的酶切位點(diǎn)，可以解決pGH19質(zhì)粒插入EGFP基因后無(wú)法插入目的基因的問(wèn)題，且可以確保成功插入目的基因后，不會(huì)破壞EGFP基因活性和pGH19質(zhì)粒原有功能，即在保障pGH19質(zhì)粒原有功能的前提下，又可使目的蛋白帶有綠色熒光標(biāo)簽。

本發(fā)明所述限制性內(nèi)切酶A可以為EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、Xma I限制性內(nèi)切酶、SmaI限制性內(nèi)切酶、BamH I限制性內(nèi)切酶、BstB I限制性內(nèi)切酶、Xho I限制性內(nèi)切酶或EcoR V限制性內(nèi)切酶。